一种ATP多位点结合荧光增强型探针分子及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于荧光探针技术领域，具体公开了一类基于罗丹明衍生物的ATP多位点结合的荧光增强型探针分子及其制备方法和应用。本发明专利技术将多胺类化合物和含醛基苯硼酸引入到罗丹明体系，得到了多个结构简单的ATP多位点结合的荧光探针。本发明专利技术合成的荧光探针能够通过ATP多位点结合（离子相互作用，以及其他氢键相互作用、共价键作用和π‑π堆叠作用）诱导罗丹明螺环结构高效开环并产生强烈的荧光，该类荧光探针能够高效选择性地识别ATP，不受其他磷酸根离子的干扰。本发明专利技术合成的荧光探针能够选择性对A375细胞线粒体标记，可以作为一种特异性的线粒体靶向荧光探针。本发明专利技术合成的荧光探针通过荧光成像可以实时监测A375细胞线粒体ATP浓度变化。

A multi-site ATP-binding fluorescence-enhanced probe molecule and its preparation method and Application

The invention belongs to the technical field of fluorescent probe, and specifically discloses a fluorescent enhanced probe molecule based on ATP multi-site binding of rhodamine derivatives, its preparation method and application. The invention introduces polyamine compounds and aldehyde-containing phenylboric acid into rhodamine system, and obtains a plurality of fluorescent probes with simple ATP multi-site binding. The fluorescent probe synthesized by the invention can induce rhodamine spiral ring structure to open efficiently and generate strong fluorescence by ATP multi-site binding (ion interaction, other hydrogen bond interaction, covalent bond interaction and pi_pi stacking interaction). The fluorescent probe can efficiently and selectively recognize ATP without interference from other phosphate ions. The fluorescent probe synthesized by the invention can selectively label the mitochondria of A375 cells, and can be used as a specific mitochondrial targeting fluorescent probe. The fluorescent probe synthesized by the invention can monitor the changes of mitochondrial ATP concentration in A375 cells in real time by fluorescence imaging.

【技术实现步骤摘要】
一种ATP多位点结合荧光增强型探针分子及其制备方法和应用
本专利技术属于荧光探针
，尤其涉及一种ATP多位点结合荧光增强型探针分子及其制备方法和应用。
技术介绍
ATP在很多生物进程中起着非常重要的作用，尤其是线粒体ATP浓度在调节细胞能量状态中是必不可少的。ATP浓度被广泛应用于食品质量和细胞存活率检测。因此，线粒体中ATP选择性识别和ATP浓度实时监测变得尤为重要，已成为当前广大科研工作者研究的重要课题之一。然而，目前的ATP荧光探针大多缺乏对特定生物阴离子的选择性、需要较高响应浓度且线粒体靶向性差。基于这样的原因，很少的荧光探针被成功地用于线粒体ATP检测和活细胞成像(LuWang,LinYuan,XianZeng,JuanjuanPeng,YongNi,JunChengEr,WangXu,BikramKeshariAgrawalla,DongdongSu,BeomsueKim,Young-TaeChang.AngewandteChemieInternationalEdition.2016；55:1773-1776.Kai-YueTan,Chun-YanLi,Yong-FeiLi,JunjieFei,BinYang,Ya-JunFu,FangLi.AnalyticalChemistry.2017；89:1749-1756.)。近年来，具有颜色变化的罗丹明荧光增强型探针引起了广泛关注。罗丹明衍生物自身闭环结构无色、无荧光，而多因素(如pH、UV、某些金属离子等)诱导内酰胺结构开环后，其具有较强的荧光发射、并呈现粉红色。因而，专利技术一种基于罗丹明衍生物的ATP多位点结合荧光增强型探针分子将具有非常重要的意义。在这个检测体系中，ATP多位点结合(离子相互作用，以及其他氢键相互作用、共价键作用和π-π堆叠作用)诱导罗丹明螺环结构高效开环并产生强烈的荧光，该类荧光探针对线粒体ATP表现出很好的选择性和较高的灵敏度，不受其他磷酸根离子的干扰；并能够标记活细胞线粒体和通过荧光成像实时监测线粒体ATP浓度变化。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于罗丹明衍生物的ATP多位点结合荧光增强型探针分子，并将其应用于生物医学领域，具体研究了作为制备ATP荧光探针和活细胞荧光成像的应用。本专利技术的技术方案为：首先选择罗丹明衍生物(罗丹明B或罗丹明6G)作为荧光发射团，然后与多胺基化合物反应，制备具有胺基官能团修饰的罗丹明衍生物；最后与含有醛基的苯硼酸反应制备具有仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物(Rh-NH-PBA)。通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱分析这些罗丹明衍生物与ATP相互作用，确认这些化合物具有优异的ATP选择性，同时能够通过荧光成像实时监测线粒体ATP浓度变化。本专利技术所述的ATP荧光探针是含仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物(罗丹明B或罗丹明6G)，其结构通式为：其中，n＝0或1或2，R1＝B(OH)2或H，R2＝B(OH)2或H，R1和R2不同。本专利技术所述的含仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物(Rh-NH-PBA)的ATP荧光探针合成方法，其具体步骤为：(1)在反应容器中，将罗丹明衍生物加入到无水乙醇中搅拌至完全溶解，然后滴加多胺类化合物，在76-90℃下搅拌回流24-48h，溶液颜色变淡或至无色，反应结束，冷却到室温后旋蒸除去溶剂，然后加入水和二氯甲烷萃取洗涤，收集有机相，旋蒸除去溶剂，用体积比6:0.2～6:0.8的二氯甲烷和乙醇混合液梯度洗脱过硅胶柱色谱分离提纯，得到含氨基的罗丹明衍生物中间体Rh-NH2；优选的，罗丹明衍生物和无水乙醇的用量比例为1.0mmol：(10-30)mL；罗丹明衍生物和多胺类化合物的摩尔比为＝1：(10-20)；萃取所用水和二氯甲烷的体积比为1：(1～4)；(2)将步骤(1)得到的产物Rh-NH2与含醛基的苯硼酸在无水乙醇中于76-90℃回流反应10-24h，冷却到室温后旋蒸除去溶剂，然后用乙醚洗涤沉淀，离心、干燥，得到含仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物(Rh-NH-PBA)的ATP荧光探针。优选的，步骤(2)中，Rh-NH2、含醛基的苯硼酸和无水乙醇的用量比例为0.5mmol：0.5mmol：(8-16)mL；步骤(1)所述的罗丹明衍生物优选为罗丹明B或罗丹明6G；步骤(1)所述的多胺类化合物优选为乙二胺、二乙烯三胺或三乙烯四胺；步骤(2)所述的含醛基的苯硼酸化合物优选为邻醛基苯硼酸或对醛基苯硼酸；上述制得的ATP荧光探针为含0-2个仲胺基的罗丹明类苯硼酸化合物。进一步，将上述ATP荧光探针应用于选择性识别ATP。进一步，将上述ATP荧光探针应用于标记活细胞线粒体。进一步，将上述ATP荧光探针应用于实时监测活细胞线粒体ATP浓度变化的荧光成像。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：1.本专利技术合成的ATP荧光探针分子能够高效、选择性的识别线粒体ATP，同时能够实时检测线粒体ATP浓度变化，具有很好的实际应用价值。2.本专利技术合成方法简单，容易大量合成，具有很好的应用价值。附图说明图1：ATP荧光探针选择性的识别活细胞线粒体ATP的示意图。图2：实施例1中合成ATP荧光探针Rh6G-NH-PBA的反应流程图。图3：实施例2中合成ATP荧光探针RhB-NH-PBA的反应流程图。图4：Rh6G-NH-PBA(25.0μM)与ATP作用的紫外吸收(a)和荧光发射光谱图(b)。图5：RhB-NH-PBA(10.0μM)与ATP作用的荧光发射光谱图。图6：Rh6G-NH-PBA选择性识别ATP的荧光光谱图(a)和荧光强度变化柱状图(b)。图7：RhB-NH-PBA选择性识别ATP的荧光光谱图(a)和荧光强度变化柱状图(b)。图8：加入ATP前后，Rh6G-NH-PBA荧光强度随时间响应变化图。图9：Rh6G-NH-PBA对A375细胞线粒体标记的荧光成像图：(a)Rh6G-NH-PBA染色，(b)用Mito-TrackerGreen染色，(c)DAPI染色，(d)a-c重叠图。图10：RhB-NH-PBA对A375细胞线粒体标记的荧光成像图：(a)RhB-NH-PBA染色，(b)用Mito-TrackerGreen染色，(c)DAPI染色，(d)a-c重叠图。图11：Rh6G-NH-PBA实时监测A375细胞线粒体ATP浓度变化的荧光成像图。具体实施方式下面专利技术人将结合实施例和附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。产物结构的表征使用：核磁1H和13C谱(Bruker400)，液相色谱-质谱联用仪(1200LC-6520Q-TOFMS)。产物光学性能表征使用：紫外可见光谱仪(Cintra20,GBC,Australia)，荧光光谱仪(F-7000,Hitachi，Japan)。产物的生物实验表征使用：荧光显微镜(AMGEVOSf1microscope)，激光共聚焦显微镜(LSM780confocalmicroscope)。A375细胞购自清华大学危岩老师课题组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ATP荧光分子探针，其特征在于，所述荧光分子探针是含仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物，其结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种ATP荧光分子探针，其特征在于，所述荧光分子探针是含仲胺链段和苯硼酸修饰的罗丹明衍生物，其结构通式如下：其中，n＝0或1或2，R1＝B(OH)2或H，R2＝B(OH)2或H，R1和R2不同。2.根据权利要求1所述的ATP荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)在反应容器中，将罗丹明衍生物加入到无水乙醇中搅拌至完全溶解，然后滴加多胺类化合物，在76-90℃下搅拌回流至少24h，溶液颜色变淡或至无色，反应结束，冷却到室温后旋蒸除去溶剂，然后加入水和二氯甲烷萃取洗涤，收集有机相，旋蒸除去溶剂，用体积比6:0.2～6:0.8的二氯甲烷和乙醇混合液过柱色谱分离提纯，得到含氨基的罗丹明衍生物中间体Rh-NH2；所述的罗丹明衍生物为罗丹明B或罗丹明6G；所述的多胺类化合物为乙二胺、二乙烯三胺或三乙烯四胺；罗丹明衍生物和多胺基化合物的摩尔比为＝1：10-20；(2)将步骤(1)得到的产物Rh-NH2与含醛基的苯硼酸在无水乙醇中于76-90℃回流反应至少10h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许泽军，刘亚楠，张道洪，张俊珩，程娟，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42