一种樟疫霉菌的检测靶标Pcin100006及其专用检测引物和快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种樟疫霉菌的检测靶标Pcin100006及其专用检测引物和快速检测方法，该检测靶标Pcinn100006的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。专用检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成。本发明专利技术的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为樟疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于樟疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对田间土壤中的樟疫霉菌进行检测。本发明专利技术对樟疫霉菌引起的疫病防治和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

A Detection Target Pcin100006 for Phytophthora Cinnamomi and Its Primers and Rapid Detection Method

The invention discloses a detection target Pcin100006 for Phytophthora camphora, a special detection primer and a rapid detection method. The DNA sequence of the detection target Pcinn100006 is shown in SEQ ID NO.1. The special detection primers consist of forward-inward primer FIP, reverse-inward primer BIP, forward-outward primer F3, reverse-outward primer B3, forward-loop primer LF and reverse-loop primer LB. The detection method of the invention has high accuracy, strong specificity, convenient operation, good practicability, achieves constant temperature amplification, and also provides a new technical platform for the detection of Phytophthora camphora, which can be used for high sensitivity and rapid detection of Phytophthora camphora, and identifies pathogens at the initial stage of disease infection, and can detect Phytophthora camphora in field soil. The invention is also of great significance for the prevention and control of Phytophthora camphorae-induced blindness, the reduction of production cost and the reduction of environmental pollution of pesticides.

【技术实现步骤摘要】
一种樟疫霉菌的检测靶标Pcin100006及其专用检测引物和快速检测方法
本专利技术属于樟疫霉菌的基因检测
，具体涉及一种樟疫霉菌的检测新靶标Pcin100006及樟疫霉菌的快速LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
技术介绍
樟疫霉菌(Phytophthoracinnamomi)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。樟疫霉可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击。樟疫霉菌寄主广泛，可以侵染上千种植物。据报道，樟疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低樟树疫病引起的损失。传统的樟疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕樟疫霉菌。传统方法在樟疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测樟疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，核酸扩增技术主要包括常规PCR为基础的变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。目前，基于常规PCR为基础的变温扩增技术主要包括普通PCR、巢式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等，国内外研究者采用这些检测技术(Wang，etal.，2006)检测疫霉病菌，目前很多研究都是针对单种疫霉菌的，但在实际检验检疫工作中，要求一次检验可以同时对多种病原菌进行检测的高通量检测技术的需求越来越高。KatarzynaSikora等(Sikora，etal.，2012)利用Padlock探针结合microarray芯片技术进行了23种疫霉菌的高通量检测，但诊断方法程序繁琐、周期长、成本高，同时也需要使用昂贵的仪器和试剂等，不适用于基层、欠发达国家和地区；多重PCR技术尽管可以对几种病原菌同时检测，但是几对引物的同时扩增容易导致非特异性和漏检等现象。近年来发展起来的环介导等温扩增技术(LAMP，Loop-mediatedisothermalamplification)可望为克服上述缺陷提供好的方法，该技术具有特异性强、灵敏高、等温、操作简单、产物易检测可视化的特点。LAMP技术是由Notomi等(Notomi，etal.，2000)报道的一种新型核酸扩增技术，该方法主要是利用能够识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)进行扩增反应的一种等温扩增技术。LAMP检测体系的基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在30～60min扩增109～1010倍，其特异性较高，同时在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁，其可形成乳白色沉淀，对靶基因序列的检测只需通过肉眼观察有无乳白色沉淀，从而判断扩增与否。LAMP检测技术已经成功用于细菌(Pan，etal.，2011)、病毒、真菌(Niessen&Vogel，2010)的检测中，在卵菌的应用中主要由戴婷婷等首次应用LAMP技术检测大豆疫霉菌(Dai，etal.，2012，戴婷婷，etal.，2013)。整个检测过程仅需60min，即可通过肉眼直接目测实验结果，其建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉菌进行快速检测。随着该技术体系的完善与发展，其在疫霉菌分子检测领域的应用也必将越来越广泛与深入。综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的LAMP检测技术体系对提升对疫霉属的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。目前，现有的樟疫霉菌LAMP检测技术体系还不能完全满足使用需求。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中樟疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本专利技术的目的是提供一种新的樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006及其LAMP检测引物组合物。本专利技术的另一目的是提供上述樟疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本专利技术另一目的是提供上述樟疫霉菌的LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。所述的樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006，其蛋白序列如SEQIDNO.2所示。所述的检测靶标Pcinn100006在检测樟疫霉菌中的应用。所述的樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006的专用检测引物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-CGAAGGACGAGGTGAAGGTGGACGCCCATACATCACATACG-3′：BIP：5′-AAGGCCGGCTACATGTACTCGTCTCGGGCAAGATGACTTC-3′：F3：5′-GTTCTGCGCGATTTGGTTAG-3′：B3：5′-GCGGATCTTCCGATCTGGTA-3′：LF：5′-AACGTGACGCCGGCAACAA-3′；LB：5′-TGTTGCCTCCGGGCTGT-3′。所述的专用引物在检测樟疫霉菌中的应用。一种检测樟疫霉菌的试剂盒，含有一次检测用量以上体积的检测溶液，所述的检测溶液至少包括：1)权利要求4所述的专用引物溶液。所述的检测溶液含包括：2)必要的LAMP反应溶剂；3)DNA合成酶；4)羟基萘酚蓝。所述的试剂盒在检测樟疫霉菌中的应用。一种检测樟疫霉菌的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用权利要求4所述的专用引物或权利要求6所述的试剂盒，进行对应的LAMP检测反应；观察反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，待检微生物为樟疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，待检微生物不是樟疫霉菌。所述的检测樟疫霉菌的方法，LAMP反应程序为：60℃～65℃，60～80min。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果表现在：1)发掘高信赖度特异性分子检测靶标Pcinn100006并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006，其蛋白序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的检测靶标Pcinn100006在检测樟疫霉菌中的应用。4.权利要求1所述的樟疫霉菌的检测靶标Pcinn100006的专用检测引物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-CGAAGGACGAGGTGAAGGTGGACGCCCATACATCACATACG-3′；BIP：5′-AAGGCCGGCTACATGTACTCGTCTCGGGCAAGATGACTTC-3′；F3：5′-GTTCTGCGCGATTTGGTTAG-3′；B3：5′-GCGGATCTTCCGATCTGGTA-3′；LF：5′-AACGTGACGCCGGCAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴婷婷，焦彬彬，胡涛，徐月，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32