马铃薯晚疫病菌单孢子囊分离方法技术

本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及一种马铃薯晚疫病菌单孢子囊分离方法。在已有的悬浮液分离方法的基础上，利用单个孢子囊含有多个游动孢子，且每个游动孢子遗传物质相同的特点，分离获得单个孢子囊后，采用低温刺激其释放游动孢子，形成了一套分离单个孢子囊的新方法。改进后的方法成功率提高了近5倍，操作时间减少了一半，同时操作难度也大大降低，是病原群体研究试验中快速、大批量分离单孢子囊的一种行之有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种。
技术介绍
马铃薯晚疫病是马铃薯生产上最重要的病害，该病也是植物病理学中的最经典的 病害之一，引起该病的病原菌是致病疫霉。世界各地马铃薯产区都有发生，流行年一般减产 30%。19世纪40年代爱尔兰马铃薯大量死亡，减产一半，使100多万人饿死，200万人移居海 外。当时对马铃薯死亡的原因有各种推测，1842年冯?马蒂尤斯(vonMartius)首先认为是 病菌引起，1857年斯皮尔许奈德（Speerschneider)证明叶上霉菌能引起块茎腐烂。1861~ 1863年德巴利(deBary)确定了叶上病斑和块茎腐烂都是由一种真菌引起并给鉴定了病原 菌。在中国马铃薯产地都有发生，西南地区较为严重，东北、华北与西北多雨潮湿的年份为 害较重，如1950年大流行年，这些地区损失30%~50%。以后的10年内又有5年是流行年。 病菌主要以菌丝体在薯块中越冬，播种带菌薯块，导致不发芽或发芽后出土即死 去，有的出土后成为中心病株，病部产生饱子囊借气流传播进行再侵染，形成发病中心，致 该病由点到面，迅速蔓延扩大;病叶上的饱子囊还可随雨水或灌溉水渗入土中侵染薯块，即 形成病薯，成为翌年主要侵染源。病菌喜日暖夜凉高湿条件，相对湿度95 %以上，18-22C条 件下，有利饱子囊的形成，冷凉（10-13C，保持1-2小时)又有水滴存在，有利饱子囊萌发产 生游动饱子，温暖（24-25C，持续5-8小时)有水滴存在，有利饱子囊直接产出芽管，因此多 雨年份，空气潮湿，或温暖多雾条件下发病重。 目前针对马铃薯晚疫病菌研究很多，但现有马铃薯晚疫病菌研究中单孢子囊分离 方法操作难度大、耗时久、成功率低。直接从新鲜薯片上分离马铃薯晚疫病菌，薯片上的杂 菌难以去除，在分离过程中会造成大量污染，难以得到纯的马铃薯晚疫病菌株用于实验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，解决了现行马铃 薯晚疫病菌研究中单孢子囊分离方法操作难度大、耗时久、成功率低的问题。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： (1) 用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取少许菌丝，在含有200U1无菌水的2ml离心管 中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1500rpm/min的涡旋机涡 旋30s，重复两次；随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1 个/2ul; (2) 于一片载玻片上放置三个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在三个盖玻片上滴一滴 孢子囊悬浮液，然后于10X10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖 0 · 8cm X 0 · 8cm的黑麦培养基，随后将其转移至灭菌过的空培养皿中，封口； (3 )将培养皿放至4°C冰箱中低温处理2-3h，刺激孢子囊释放游动孢子，然后转移到11 °C的环境存放16-18h，促进游动孢子萌发，最后放置18°C的恒温培养箱中培养4-10天； (4)待萌发的孢子囊在黑麦培养基块上产生菌丝，在超净工作台中将其转移至黑麦培 养基平板上培养，于18°C恒温培养箱中培养，即得到由单个孢子囊生长而来的菌株。 黑麦培养基:取50g黑麦于烧杯中，用自来水冲洗干净，加入去离子水刚好淹没，室 温下浸泡15~20h，充分研磨后于65°C水浴2h，用四层纱布过滤去渣，加热煮沸并于滤液中加 入12g琼脂粉，待琼脂粉充分融化后用去离子水定容至1L，分装，灭菌。 本专利技术的优点在于： 本研究在已有的悬浮液分离方法的基础上，利用单个孢子囊含有多个游动孢子，且每 个游动孢子遗传物质相同的特点，分离获得单个孢子囊后，采用低温刺激其释放游动孢子， 形成了一套分离单个孢子囊的新方法。改进后的方法成功率提高了近5倍，操作时间减少了 一半，同时操作难度也大大降低，是病原群体研究试验中快速、大批量分离单孢子囊的一种 行之有效的方法。 现有技术采用水琼脂平板划线法分离100个孢子囊，最后仅能存活12个分离物，存 活率仅为12%;与现有技术相比，采用改进后的方法分离同一菌株的100个孢子囊，最后能存 活68个分离物，存活率达到了68%，存活率是改进前的5.7倍。从分离效率来看，水琼脂平板 划线法熟练操作后，lh最多仅能分离20个孢子囊。而改进后的方法，lh能分离出40个孢子 囊，时间减少了一半，大大提高了操作效率。【附图说明】图1发病的马铃薯叶片。 图2置于载玻片上的含有孢子囊悬浮液的盖玻片。 图3正在镜检中的孢子囊悬浮液。 图4盖上黑麦培养基块的孢子囊悬浮液。【具体实施方式】 实施例1 (1) 用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取少许菌丝，在含有200ul无菌水的2ml离心管 中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1500rpm/min的涡旋机涡 旋30s，重复两次；随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1 个/2ul; (2) 于一片载玻片上放置三个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在三个盖玻片上滴一滴 孢子囊悬浮液，然后于10X10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖 0 · 8cm X 0 · 8cm的黑麦培养基，随后将其转移至灭菌过的空培养皿中，封口； (3) 将培养皿放至4°C冰箱中低温处理3h，刺激孢子囊释放游动孢子，然后转移到11°C 的环境存放18h，促进游动孢子萌发，最后放置18°C的恒温培养箱中培养10天； (4) 待萌发的孢子囊在黑麦培养基块上产生菌丝，在超净工作台中将其转移至黑麦培 养基平板上培养，于18°C恒温培养箱中培养，即得到由单个孢子囊生长而来的菌株。 实施例2 (1)用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取少许菌丝，在含有200ul无菌水的2ml离心管 中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1500rpm/min的涡旋机涡 旋30s，重复两次；随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1 个/2ul; (2) 于一片载玻片上放置三个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在三个盖玻片上滴一滴 孢子囊悬浮液，然后于10X10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖 0 · 8cm X 0 · 8cm的黑麦培养基，随后将其转移至灭菌过的空培养皿中，封口； (3) 将培养皿放至4°C冰箱中低温处理2h，刺激孢子囊释放游动孢子，然后转移到11°C 的环境存放16h，促进游动孢子萌发，最后放置18°C的恒温培养箱中培养4天； (4) 待萌发的孢子囊在黑麦培养基块上产生菌丝，在超净工作台中将其转移至黑麦培 养基平板上培养，于18°C恒温培养箱中培养，即得到由单个孢子囊生长而来的菌株。 实施例3 (1) 用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取少许菌丝，在含有200U1无菌水的2ml离心管 中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1500rpm/min的涡旋机涡 旋30s，重复两次；随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1 个/2ul; (2) 于一片载玻片上放置三个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在三个盖玻片上滴一滴 孢子囊悬浮液，然后于10X10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖 0 · 8cm X 0 · 本文档来自技高网...

【技术保护点】
马铃薯晚疫病菌单孢子囊分离方法，其特征在于：所述的方法包括如下：（1）用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取菌丝，在含有200ul无菌水的2ml离心管中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1500rpm/min的涡旋机涡旋30s，重复两次；随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1个/2ul；（2）于一片载玻片上放置三个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在三个盖玻片上滴一滴孢子囊悬浮液，然后于10×10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖0.8cm×0.8cm的黑麦培养基，随后将其转移至灭菌过的空培养皿中，封口；（3）将培养皿放至4℃冰箱中低温处理2‑3h，刺激孢子囊释放游动孢子，然后转移到11℃的环境存放16‑18h，促进游动孢子萌发，最后放置18℃的恒温培养箱中培养4‑10天；（4）待萌发的孢子囊在黑麦培养基块上产生菌丝，在超净工作台中将其转移至黑麦培养基平板上培养，于18℃恒温培养箱中培养，即得到由单个孢子囊生长而来的菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢业焜，吴娥娇，詹家绥，李冬亮，靳宇佳，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35