本发明专利技术公开了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real‑time PCR检测引物及方法，检测引物的核苷酸序列为：上游引物Fv‑QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’，下游引物Fv‑QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；本发明专利技术设计轮枝镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于轮枝镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明专利技术能快速准确检测三七种植土壤以及三七病株中轮枝镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗的带菌分子检测提供技术支持。
Real-time PCR primers and methods for detection of Fusarium rotiferum, a pathogen of Panax notoginseng root rot
The invention discloses a Real time PCR detection primer and method for Fusarium rotatum, a pathogenic fungus of Panax notoginseng. The nucleotide sequence of the detection primer is: upstream primer Fv QF: 5'GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3', downstream primer Fv QR: 5'TGTTGGAGTAGTTACCCTATGTTCA3'; The invention designs specific primers of Fusarium rotatum and establishes a standard curve for the determination of Fusarium rotatum. Sex quantitative molecular detection and disease accurate diagnosis; The invention can quickly and accurately detect the quantitative dynamic changes of Fusarium Rotifera in the soils of Panax notoginseng and the infected plants of Panax notoginseng, thus providing technical support for soil treatment of Panax notoginseng, early diagnosis and dynamic monitoring of root rot and molecular detection of Panax notoginseng seeds and seedlings.
【技术实现步骤摘要】
三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法
本专利技术涉及一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌的快速分子检测，同时可实现田间三七根腐病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害的分子生物学检测
技术介绍
三七[Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen)]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，其干燥根及根茎入药，是我国传统名贵中药材；其味甘、微苦、性温，归肝、胃、大肠经，具有化瘀止血、消肿止痛等作用。研究表明其主要成分有三萜类化合物甾醇类、人参炔三醇、黄酮类、糖类、微量元素和氨基酸等(DaweiL,JiaqingC,XiuliB,etal.Newdammarane-typetriterpenoidsfromtheleavesofPanaxnotoginsengandtheirproteintyrosinephosphatase1Binhibitoryactivity.JournalofGinsengResearch,2014,38(1):28-33)。其中，三七总皂苷为其主要的药用活性成分，在三七中含量约为12%（郑丽华,卢昌均,周志昆.HPLC测定三七总皂苷中5种皂苷的含量及稳定性考察.中医药临床杂志,2012,24(1):73-75)。三七皂苷是治疗心血管疾病的活性成分，也是目前研究较为系统的化学物质，三七皂苷具有扩张冠状动脉、增加冠状血流量、降低血小板表面活性、抗动脉粥样硬化、抑制血小板活化、降低血黏度、黏附和聚集、抗血栓形成等作用(赵铁夫,王盛宇,陈宏.不停跳冠状动脉旁路移植术术前应用三七三醇皂苷抗血小板的疗效研究.中国医药,2015,10(3):309-311)。至今为止，已有70余种三萜类皂苷分别从三七的根茎、根块及花等组织中分离鉴定出来，它们均属于达玛烷型四环三萜类。它们具有非常广阔的应用和开发前景。三七独特的药效使得它在民间具有不可替代的地位，也是复方丹参滴丸、云南白药、血塞通、片仔癀等药品的主要原料，是我国少有的高附加值药用经济植物。随着近年来三七产业的快速发展，三七种植面积的逐年增加，三七在大规模生产中面临的问题也随之而来，当前制约三七可持续发展的原因有两个方面：一是连作障碍问题严重，在三七的实际生产中适合种植三七的土地日益紧张，需要间隔10-15年以上才能复种，连作障碍大大增加了三七的种植成本。二是没有优良的新品种，三七种质资源严重退化，三七病害种类逐年增大，对三七的大规模生产造成巨大损失(崔秀明,黄路琦,等.中国三七产业现状及发展对策.中国中药杂志，2014,39(4):553-557)。三七的主要病害是根腐病，主要症状为根部腐烂，呈湿腐和干腐两型，地上部黄萎或青枯，常年损失5%～20%，严重的达70%，损失占各种三七病害的70%～85%；(蒋妮,覃柳燕,叶云峰.三七病害研究进展.南方农业学报,2011,42(9):1070-1074)。而轮枝镰刀菌是根腐病的致病菌之一。轮枝镰刀菌是属于镰刀属的一种真菌，菌丝呈白色长毛状，生长速度较快，2-3天即可生长成熟（兰楠.轮枝镰刀菌velvet复合物生物学功能及粗糙脉孢菌有性发育分子调控机制的研究,[学位论文]2013-中国科学院大学:微生物学）。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术，以其具有灵敏、特异等优点在植物病理学研究领域如植物病原菌的鉴定、病原菌分类、病原菌生理小种鉴定、病原菌群体遗传结构分析、抗病基因克隆等多方面得到广泛的应用。而实时荧光定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，可以在短时间内处理大量样本获得大量有效数据，在病原菌初始菌源量或潜伏侵染病原菌的定量分析、病原菌抗药性频率监测、寄主抗病性快速测定、病害流行动态监测等研究领域方面具有独特的应用价值(JohnsonCE,PremasuthanA,SatkoskiTraskJ,etal.Speciesidentificationofcannabissativausingreal-timequantitativePCR(qPCR).JournalofForensicSciences,2013,58(2):486-490)；目前在植物病理学领域已经开发了许多病原菌的常规PCR检测方法，可以在此基础上将常规PCR转化为实时荧光定量PCR，更好地直接用于病害的定量研究；另外随着此技术研究的不断深入和改进，成本的降低和更多更好的荧光标记方法的出现，实时荧光定量PCR在植物病害流行学方面将有更广泛的应用前景。
技术实现思路
针对现有技术中对三七根腐病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗时长，对鉴定经验要求高、准确度低，无法进行病原菌的定量分析，难以满足三七根腐病菌的快速准确诊断的现状，本专利技术提供了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：本专利技术首先提供了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物，其核苷酸序列为：上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；所述引物Fv-QF和Fv-QR对三七根腐病菌轮枝镰刀菌特异性扩增出113bp的产物。本专利技术还提供了一种三七根腐病菌的快速检测方法，包括以下步骤：(1)提取三七样品或土壤的DNA；(2)以提取的三七样品或土壤的DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增；实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL，其包含2×SYBRGreenMix10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fv-QF(2μmol/L)1μL、下游引物Fv-QR(2μmol/L)1μL、DNA模板1μL；在荧光定量PCR仪上扩增，扩增谱为95℃2min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃1min，62℃30s，72℃1min，于72℃时测定荧光值，每个循环结束后自动收集并记录荧光信号；（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立制备浓度为40ng/μL的重组质粒pGEM-T-FvBlh作为标准品，进行10倍的浓度梯度稀释，共设置5个梯度，浓度在0.004ng/μL～40ng/μL范围内，稀释介质为无核酸酶水；对5个梯度的标准品进行实时荧光定量PCR反应，每个梯度设置3次重复。荧光定量PCR反应体系及扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；(4)若有荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌轮枝镰刀菌，将上步所得的Ct值带入本专利技术构建的标准曲线中，计算得到检测样品中轮枝镰刀菌的数量。本专利技术的优点在于：（1）准确性高：本专利技术是根据基因序列在真菌种内的高度保守性和属种间可变性的特点设计对三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌具有特异扩增作用的Real-timePCR引物。已经对不同种植基地的三七根腐病样品进行了检测分析，只在根腐病病株的腐烂根部能特异性地扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real‑time PCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：上游引物Fv‑QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’下游引物Fv‑QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’。
【技术特征摘要】
1.一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’。2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）提取三七样品或土壤的DNA；（2）以提取DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃2min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃1min，62℃30s，72℃1min，于72℃时测定荧光值，每个循环结束后收集并记录荧光信号；（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立制备浓度在0.004ng/μL～40ng/μL范围内的重组质粒pGEM...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，李欣，崔秀明，邱炳玲，张应鹏，李珊，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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