抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用制造技术

本发明专利技术公开抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用，本发明专利技术所述融合蛋白包括ABP‑L‑DFE的结构，其中ABP位于融合蛋白的N端，表示具有结合抗体功能的结构域，L表示连接肽，DFE表示具有DNA片段化功能的结构域。本发明专利技术所述的重组融合蛋白可以改善ChIP‑seq技术，简化操作，提高数据质量，降低操作难度，扩展应用范围，尤其是在珍贵、少量细胞上的应用。

Recombinant fusion protein targeting antibody and its application in epigenetics

The present invention discloses an antibody-targeted recombinant fusion protein and its application in epigenetics. The fusion protein includes the structure of ABP L DFE, in which ABP is located at the N-terminal of the fusion protein, representing a domain with binding antibody function, L representing a ligand peptide, and DFE representing a domain with DNA fragmentation function. The recombinant fusion protein of the invention can improve ChIP SEQ technology, simplify operation, improve data quality, reduce operation difficulty and expand application scope, especially in precious and small amount of cells.

【技术实现步骤摘要】
抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用。
技术介绍
对于多细胞生物来说，比如人类，其每一个细胞的遗传物质(DNA)都来源于相同的受精卵，所以其携带的遗传信息，即DNA序列都是相同的，但是不同组织中的细胞，如皮肤和肝脏细胞，又表现出不同的形态和性质。相同的遗传信息却发育出不同类型的细胞，是由于不同细胞的基因表达模式差异引起的。而这些基因表达模式是受细胞内特定转录因子的结合、染色质和DNA的状态影响的。表观遗传学就是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传学研究的内容包括DNA甲基化(DNAmethylation)，基因组印记(genomicimprinting)，母体效应(maternaleffects)，基因沉默(genesilencing)，休眠转座子激活等。染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是一种常用的研究表观遗传学的技术。其基本原理是将染色质和与之相互作用的转录因子和组蛋白通过甲醛等物质交联起来，然后将染色质通过超声打碎成较小的片段，加入针对特定转录因子或特殊修饰的组蛋白的抗体，通过proteinA/proteinG微球或者磁珠将抗体-转录因子-染色质复合物拖下来，通过PCR或者测序的方法检测与目的蛋白相结合的DNA序列，进而研究这些转录因子在细胞发育或者生长中的作用位点。最近几年快速发展的二代测序技术(NGS，nextgenerationsequencing)与传统ChIP技术相结合，发展出的ChIP-sequencing(简称ChIP-seq)技术，进一步扩展了ChIP技术在表观遗传学方面的研究应用。然而在传统ChIP技术中，需要先用甲醛将与DNA相互作用的蛋白固定起来，在这个过程可能会造成一些非相关蛋白被交联，形成非特异性的背景(假阳性)。有一些作用力比较小的转录因子或者由于甲醛交联不充分，后续超声碎裂DNA时蛋白和DNA之间的作用被破坏，造成假阴性，而且传统ChIP耗时长(4天)，还需要有高亲和力的抗体，因为低亲和力的抗体很难有效将蛋白和DNA复合物“拖下来”，这也进一步限制了ChIP的使用范围。此外，传统ChIP-seq需要甲醛交联细胞并分离抗体和染色体片段的复合物，然后再进行建库和测序，需要较多的样本细胞，需要高亲和力的抗体，需要较长时间和复杂的操作，测序的分辨率不高，测序深度较大，成本高。而且不适用于胚胎发育、干细胞以及病理样本等珍贵样本的表观遗传学研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用，本专利技术所述的重组融合蛋白可以改善ChIP-seq技术，简化操作，提高数据质量，降低操作难度，扩展应用范围，尤其是在珍贵、少量细胞上的应用。本专利技术的目的可以通过以下措施达到：本专利技术的第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括ABP-L-DFE的结构，其中ABP位于融合蛋白的N端，表示具有结合抗体功能的结构域，L表示连接肽，DFE表示具有DNA片段化功能的结构域。专利技术人发现DNA片段化酶(DFE)和抗体结合蛋白(ABP)之间的连接顺序对两个功能单元的作用有较大影响。比如ABP-L-Tn5m和Tn5m-L-ABP的抗体结合与DNA切割活性就有明显差异。专利技术人经过大量实验筛选发现，ABP-L-DFE的总体活性优于DFE-L-ABP，可能是因为DNA片段化酶需要游离的C末端发挥活性，如Tn5m的C末端对其二聚化以及活性发挥有重要作用。所以本专利技术选择ABP-L-DFE融合蛋白形式。优选的，本专利技术所述的ABP表示具有结合抗体FC区功能的结构域。在一种实施例中，ABP表示抗体结合蛋白(antibodybindingprotein)，优选为金黄色葡萄球菌A蛋白(ProteinA)、链球菌G蛋白(ProteinG)、链球菌L蛋白(ProteinL)或其他具有结合抗体功能的蛋白或者多肽类似物。本专利技术所述金黄色葡萄球菌A蛋白(ProteinA)可以为全长金黄色葡萄球菌A蛋白、金黄色葡萄球菌A蛋白的部分功能域、金黄色葡萄球菌A蛋白突变体、带标签的全长金黄色葡萄球菌A蛋白、带标签的金黄色葡萄球菌A蛋白的部分功能域或带标签的金黄色葡萄球菌A蛋白突变体。本专利技术所述的链球菌G蛋白(ProteinG)可以为全长链球菌G蛋白、链球菌G蛋白的部分功能域、链球菌G蛋白突变体、带标签的全长链球菌G蛋白、带标签的链球菌G蛋白的部分功能域或带标签的链球菌G蛋白突变体。在一种优选的实施例中，ABP的氨基酸序列选自SEQIDNo.2或SEQIDNo.10。本专利技术所述的L表示连接肽(linker)，L的长短会影响融合蛋白的形状从而可能对融合蛋白对DNA切割的有效性以及切割位置有重大影响，本专利技术优选L长度为0-50个氨基酸，进一步优选2-50个氨基酸。当L长度为0时，表示ABP结构域和DFE结构域直接相连。本专利技术所述的L可以为1-6个氨基酸的短linker(shortlinker，简称sL)，也可以为7-20个氨基酸的中等长度linker(mediumlinker,简称mL)或>20个氨基酸的长linker(longlinker,简称lL)。本专利技术所述的L可以为柔性连接肽或刚性连接肽，专利技术人发现柔性连接肽可能会导致两个结构域之间相互作用，影响各自的功能，优选为刚性连接肽。在一种优选的实施方式中，本专利技术所述的L序列为EAAAK(SEQIDNo.6)，优选为刚性连接肽。在另一种优选的实施方式中，本专利技术所述的L序列为AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQIDNo.8)，优选为刚性连接肽。在另一种优选的实施方式中，本专利技术所述的L的氨基酸序列如SEQIDNo.14或SEQIDNo.18所示。在一种实施例中，本专利技术所述的DFE表示DNA片段化酶(DNAfragmentingenzyme)。优选的，本专利技术所述的DFE为微球菌核酸酶(Mnase)、DNA酶1(DNAseI)或TnA转座酶家族。本专利技术所述的TnA转座酶家族选自全长或者为部分功能域的以下转座酶：Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10；所述的转座酶可以带标签或者不带标签，可以为突变体或非突变体。在一种优选的实施例中，本专利技术所述的TnA转座酶家族为Tn5m(转座子5变体)，所述的Tn5m是指CN106754811A中公开的突变型Tn5转座酶，如权利要求1或3或5～7任一项所述的突变型Tn5转座酶。相比于其他DNA酶介导的ChIP-seq，本专利技术优选的带有Tn5m的融合蛋白的额外优势是可以省略片段分离、末端修复、加接头、片段分选等繁琐步骤，简化了建库操作的复杂性，进一步提高了精度和分辨率。在一种优选的实施例中，本专利技术所述的DFE的氨基酸序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.12或SEQIDNo.16所示。在一种优选的实施例中，本专利技术所述的融合蛋白选自以下任一：ABP-L-DFE1、ABP-L-DFE2、ABP-L-DF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括ABP‑L‑DFE的结构，其中ABP位于融合蛋白的N端，表示具有结合抗体功能的结构域，L表示连接肽，DFE表示具有DNA片段化功能的结构域；L长度为0‑50个氨基酸，进一步优选2‑50个氨基酸。

【技术特征摘要】
2018.10.26 CN 20181125485851.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括ABP-L-DFE的结构，其中ABP位于融合蛋白的N端，表示具有结合抗体功能的结构域，L表示连接肽，DFE表示具有DNA片段化功能的结构域；L长度为0-50个氨基酸，进一步优选2-50个氨基酸。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的L为柔性连接肽或刚性连接肽，优选为刚性连接肽。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的L为1-6个氨基酸的短linker、7-20个氨基酸的中等长度linker或>20个氨基酸的长linker；优选的，L序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.14或SEQIDNo.18所示。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，ABP为金黄色葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白、链球菌L蛋白或其他具有结合抗体功能的蛋白或者多肽类似物；其中金黄色葡萄球菌A蛋白为全长金黄色葡萄球菌A蛋白、金黄色葡萄球菌A蛋白的部分功能域、金黄色葡萄球菌A蛋白突变体、带标签的全长金黄色葡萄球菌A蛋白、带标签的金黄色葡萄球菌A蛋白的部分功能域或带标签的金黄色葡萄球菌A蛋白突变体；所述的链球菌G蛋白为全长链球菌G蛋白、链球菌G蛋白的部分功能域、链球菌G蛋白突变体、带标签的全长链球菌G蛋白、带标签的链球菌G蛋白的部分功能域或带标签的链球菌G蛋白突变体；优选的，ABP的氨基酸序列选自SEQIDNo.2或SEQIDNo.10；所述的DFE为微球菌核酸酶、DNA酶1或TnA转座酶家族；所述的TnA转座酶优选为Tn5m。5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的DFE的氨基酸序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.12或SEQIDNo.16所示。6.一种融合蛋白，选自以下任一：ABP-L-DFE1、ABP-L-DFE2、ABP-L-DFE3、ABP-L-DFE4、ABP-L-DFE5、ABP-L-DFE6、ABP-L-DFE7、ABP-L-DFE8、ABP-L-DFE9、ABP-L-DFE10、ABP-L-DFE...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯速，郑芳园，徐晓昱，张力军，曹林，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32