抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法技术

抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法。抗大黄鱼IgM单克隆抗体为杂交瘤细胞株IgM‑9G7。制备大黄鱼IgM抗原；制备杂交瘤细胞株IgM‑9G7；制备抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。大黄鱼IgM单克隆抗体是由杂交瘤细胞株IgM‑9G7产生、对大黄鱼IgM具有特异性的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够高效特异性结合大黄鱼IgM，最高效价达到2×10

Monoclonal Antibody Against IgM of Pseudosciaena crocea and Its Preparation Method

Anti-IgM monoclonal antibody of Pseudosciaena crocea and its preparation method. The monoclonal antibody against IgM of Pseudosciaena crocea is IgM_9G7, a hybridoma cell line. To prepare IgM antigen of Pseudosciaena crocea, hybridoma cell line IgM_9G7 and monoclonal antibody against IgM of Pseudosciaena crocea. IgM monoclonal antibody of Pseudosciaena crocea is produced by hybridoma cell line IgM 9G7 and has specific antibody to IgM of Pseudosciaena crocea. Immunoglobulin secreted by this cell can bind IgM of Pseudosciaena crocea efficiently and specifically, with a maximum titer of 2 x 10.

【技术实现步骤摘要】
抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法
本专利技术涉及单克隆抗体及其制备方法，尤其是涉及一种抗大黄鱼(Larimichthyscrocea)IgM的单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
我国是世界第一水产养殖大国。随着水产养殖规模的不断扩大及养殖种类的多样化，养殖病害防治问题日益突出，成为水产科研工作者的研究重点。从鱼类自身的免疫能力出发来研究其抵御疾病侵袭的机理，不仅有助于认识脊椎动物免疫系统的进化规律及特点，而且有助于促进鱼类疫苗的研制和发展。鱼类是最早出现免疫球蛋白的生物，虽然与哺乳动物的免疫系统相比还比较原始，但是已经形成包括非特异性免疫反应、细胞免疫、体液免疫等比较完善的免疫应答系统。免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是鱼类特异性免疫中关键的分子。IgM是B淋巴细胞表面分子标志，目前在大黄鱼血清中仅发现了IgM一种大黄鱼免疫球蛋白，其重链约74kD，轻链约25kD([1]韩一凡.溶藻弧菌外膜蛋白DNA重组表达载体的构建及兔抗大黄鱼IgM血清制备[D]；中国海洋大学,2006)。借助高质量的抗大黄鱼IgM单克隆抗体，可进行大黄鱼IgM+B淋巴细胞分选，将为大黄鱼B淋巴细胞的功能及相关免疫学机制研究提供帮助。此外，鱼类感染病原或接种疫苗后，鱼体产生的针对该抗原的特异性抗体，也可以通过该单克隆抗体进行特异性抗体效价检测([2]ZHANGYA,SALINASI,LIJ,etal.IgT,aprimitiveimmunoglobulinclassspecializedinmucosalimmunity[J].NatureImmunology,2010,11(9):827)。因此，利用抗大黄鱼IgM单克隆抗体，通过检测大黄鱼血清中该特异性IgM的效价，可进行大黄鱼疾病的诊断和疫苗使用效果的评价，对大黄鱼疾病的研究及防治具有重要理论和现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决利用单克隆抗体研究大黄鱼免疫球蛋白结构与功能，将单克隆抗体用于大黄鱼病原微生物检测，协助鱼病诊断与防治等，提供抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法。所述抗大黄鱼IgM单克隆抗体为杂交瘤细胞株IgM-9G7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：C2018104，保藏日期为2018年05月15日。所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：1)制备大黄鱼IgM抗原；在步骤1)中，所述制备大黄鱼IgM抗原的具体方法可为：将大黄鱼麻醉，进行尾部取血，采血后凝固，放置，待血清充分析出后，离心取上层血清，将血清与PBS稀释，过滤后使用蛋白A亲和柱和分子筛得到大黄鱼血清中的IgM抗原，该IgM抗原蛋白包括重链和轻链，所述重链为76kD，所述轻链为25kD；所述大黄鱼麻醉可采用MS-222麻醉剂麻醉；所述尾部取血可采用2mL医用注射器；所述凝固可在室温下凝固1h；所述放置可于4℃放置12h；所述离心的条件可为3000g，5min；所述将血清与PBS稀释可将血清与pH值为8的PBS等比稀释；所述过滤可采用0.45μm滤膜过滤，所述滤膜与蛋白A亲和柱、分子筛均为业内常用工具；所得到的大黄鱼血清中的IgM抗原为高纯度的大黄鱼血清IgM。2)制备杂交瘤细胞株IgM-9G7；在步骤2)中，所述制备杂交瘤细胞株IgM-9G7的具体方法可为：将纯化的大黄鱼IgM与弗氏佐剂混合，作为抗原免疫Balb/C小鼠，以骨髓瘤细胞与产生抗大黄鱼IgM抗体的小鼠脾细胞融合，得分泌抗大黄鱼IgM抗体的杂交瘤细胞株IgM-9G7。3)制备一种抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。在步骤3)中，所述制备一种抗大黄鱼IgM的单克隆抗体的具体方法可为：将杂交瘤细胞株IgM-9G7使用有限稀释法和ELISA两种方法结合，筛选出分泌抗大黄鱼IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株IgM-9G7，进而得到单克隆抗体。本专利技术所述大黄鱼IgM单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株IgM-9G7产生的、对大黄鱼IgM具有特异性的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够高效特异性结合大黄鱼IgM，最高效价达到2×104。本专利技术所述有限稀释法与ELISA分别用于提高产生的单克隆抗体纯度和检测抗体效价，均为业内常用方法。综上所述，本专利技术是将纯化的大黄鱼IgM免疫动物，取其产生抗大黄鱼IgM单克隆抗体的脾细胞(取自经抗原免疫的动物)与骨髓瘤细胞融合获得能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株能分泌抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。此抗体特异性高，灵敏度高，可用于大黄鱼IgM的结构分析、免疫应答水平检测、病原诊断以及进一步免疫学研究等，具有广阔的应用前景。附图说明图1为Western-blot检测抗大黄鱼IgM单克隆抗体的特异性。在图1中，M：标准分子量；泳道1：阴性对照样品；泳道2：大黄鱼血清样品。抗大黄鱼IgM9G7单克隆抗体可特异性识别大黄鱼IgM重链，特异性好。图2为流式细胞仪检测抗大黄鱼IgM单克隆抗体标记的淋巴细胞。在图2中，图A：无关同型一抗对照标记的头肾淋巴细胞样品；图B：9G7单克隆抗体标记的头肾淋巴细胞样品。9G7单克隆抗体可以特异性标记大黄鱼头肾淋巴细胞中的IgM+B淋巴细胞。图3为免疫荧光标记大黄鱼淋巴细胞。在图3中，深色指示DAPI标记的细胞核，浅色指示9G7单克隆抗体特异性标记的IgM。具体实施方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。一、大黄鱼IgM单克隆抗体的制备(1)制备大黄鱼特异性抗原：大黄鱼使用MS-222麻醉剂麻醉，使用2mL医用注射器收集，于室温静置1h，再于4℃静置10h，血清充分析出，3000g/min离心沉淀，取其上清，用PBS(PH8.0)等比稀释，经0.45μm滤膜过滤后上样至蛋白A亲和柱，用PBS洗脱，自动采样器收集洗脱液，并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度。最先洗脱的蛋白为杂蛋白，待杂蛋白洗净后，使用甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱蛋白，洗脱的即为较纯的大黄鱼IgM蛋白。该IgM蛋白收集后，继续上样至HiPrep16/60SepHacrylS-100HR分子筛中，使用PBS(pH8.0)洗脱，收取第一个蛋白峰的前半段，即为高纯度大黄鱼IgM；该蛋白重链分子量为74kD左右，轻链分子量为25kD左右。(2)制备一种杂交瘤细胞株：使用大黄鱼IgM蛋白免疫小鼠，以SP2/0骨髓瘤细胞与免疫后产生抗大黄鱼血清蛋白IgM抗体的Balb/C小鼠脾细胞融合得杂交瘤细胞株。(3)制备一种抗大黄鱼免疫球蛋白的单克隆抗体：以所述的杂交瘤细胞株产生该单克隆抗体，该单克隆抗体对所述的大黄鱼免疫球蛋白IgM具有特异性。步骤(2)中小鼠免疫及步骤(3)产生所述抗体的小鼠免疫具体为：以所述大黄鱼特异性抗原免疫5只雌性Balb/C小鼠，另取5只做阴性对照。每次免疫以100μg/只的大黄鱼IgM与弗氏佐剂混合免疫小鼠。免疫程序采用两次基础免疫及二次加强免疫，基础免疫时间分别为：0d，15d，加强免疫：21d，融合前3天腹腔及尾静脉途径再加强免疫一次。将免疫抗原用生理盐水稀释，第一次基础免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内，第二次基础免疫取用弗氏不完全佐剂乳化好的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗大黄鱼IgM单克隆抗体，其特征在于为杂交瘤细胞株IgM‑9G7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2018104，保藏日期为2018年05月15日。

【技术特征摘要】
1.抗大黄鱼IgM单克隆抗体，其特征在于为杂交瘤细胞株IgM-9G7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：C2018104，保藏日期为2018年05月15日。2.如权利要求1所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备大黄鱼IgM抗原；2)制备杂交瘤细胞株IgM-9G7；3)制备一种抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。3.如权利要求2所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备大黄鱼IgM抗原的具体方法为：将大黄鱼麻醉，进行尾部取血，采血后凝固，放置，待血清充分析出后，离心取上层血清，将血清与PBS稀释，过滤后使用蛋白A亲和柱和分子筛得到大黄鱼血清中的IgM抗原，该IgM抗原蛋白包括重链和轻链。4.如权利要求3所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述大黄鱼麻醉采用MS-222麻醉剂麻醉；所述尾部取血采用2mL医用注射器。5.如权利要求3所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述凝固是在室温下凝固1h；所述放置是于4℃放置12h；所述离心的条件为3000rpm，5min。6.如权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，黄宇鹏，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35