一种源于南极磷虾的降压三肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种源于南极磷虾的降压三肽及其应用，属于降血压寡肽技术领域，含有氨基酸序列为Phe‑Ala‑Ser的降压三肽，ESI‑MS测定分子量为323.35Da。降压三肽的制备方法为：将南极磷虾匀浆，加入蒸馏水和蛋白酶后，在45～55℃的环境中水酶解5.5～6.5h制备南极磷虾酶解液；将南极磷虾酶解液经超滤、阴离子交换层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，制备降压三肽。本发明专利技术降压三肽对ACE具有显著抑制作用，对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)无明显毒性作用，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子的释放，抑制内皮素，可作为发展前景较好的降血压肽段应用于降血压药品、保健产品和特殊医用食品。

A Hypotensive Tripeptide Derived from Antarctic krill and Its Application

The present invention provides an antihypertensive tripeptide derived from Antarctic krill and its application. It belongs to the technical field of antihypertensive oligopeptide. It contains a antihypertensive tripeptide with amino acid sequence Phe Ala Ser. The molecular weight determined by ESI MS is 323.35Da. The preparation method of the antihypertensive three peptide was: Antarctic krill homogenate was added to distilled water and protease, then hydrolysate 5.5 to 6.5h in water at 45~55 degree temperature to prepare Antarctic krill hydrolysate. The Antarctic krill hydrolysate was purified by ultrafiltration, anion exchange chromatography, gel column chromatography and reversed-phase high performance liquid chromatography, and then three peptides were prepared. The antihypertensive tripeptide of the invention has significant inhibitory effect on ACE, has no obvious toxic effect on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), can promote the release of endogenous relaxing factors in HUVEC cells, inhibit endothelin, and can be used as antihypertensive peptide segment with good development prospects for antihypertensive drugs, health products and special medical foods.

【技术实现步骤摘要】
一种源于南极磷虾的降压三肽及其应用
本专利技术属于降血压寡肽
，具体涉及一种源于南极磷虾的降压三肽及其应用。
技术介绍
高血压是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征(收缩压≥140毫米汞柱，舒张压≥90毫米汞柱)，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征。高血压是一种常见病和多发病。此病一般起病缓慢，患者早期常无症状，或仅有头晕、头痛、心悸、耳鸣等症状，表面上看是一种独立的疾病，实际上是引发心、脑血管和肾病变的一个重要的危险因素，如果治疗不当就会病变成为较严重的脑中风、心肌梗死和肾功能衰竭等这些常见高血压并发症。血管紧张素转化酶(ACE)是降血压肽这类抑制剂的作用靶点，它通过抑制血管紧张素转化酶的催化反应而达到降血压的作用。ACE含有两个Zn2+活性结合位点，属于金属肽酶，与Zn2+结合位点即“必须结合位点”是ACE的催化中心。通过与在ACE活性中心的Zn2+发生作用力，降血压肽等各种ACE抑制剂发生其抑制作用，ACE活性因此失活。从抑制程度来说，降血压肽与ACE的活性区域相结合紧密，产生比较强烈的竞争性抑制。它们与ACE结合的紧密程度比血管紧张素转化酶I或舒缓激肽更加坚固，紧紧地固定在ACE结合区，这样ACE就难以发挥其活性，不容易水解血管紧张素转化酶I降解生成血管紧张素II，同时还不能催化水解舒缓激肽，使其失活，从而起到降血压的作用。来源于食品的降血压肽是一类能够降低人体血压的小分子多肽的总称。一般具有活性的降血压肽的分子量在1000Da以下，通常是由蛋白酶在比较温和的情况下水解蛋白质获得。由于其降血压效果明显且对正常血压无影响、无副作用等优点，已成为目前研究的热点。南极磷虾是南极生态系统的关键物种，从生物质能来说是地球上最成功的动物物种(大约共有5亿吨)。南极磷虾具有典型的高蛋白、低脂肪的特点，含量分别为16.31％和1.3％。其蛋白水解产物中氨基酸种类丰富，含有18种氨基酸，其中包含人体所需的8种必需氨基酸。所以，南极磷虾资源被喻为人类未来的蛋白资源仓库。申请人发现以南极磷虾为原料，利用酶解技术制备南极磷虾降血压肽的工艺研究处于空白阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对ACE具有显著抑制作用，对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)无明显毒性作用，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子(NO)的释放，抑制内皮素(ET-1)的生成的源于南极磷虾的降压三肽，该降压三肽可作为发展前景较好的降血压肽段应用于降血压药品、保健产品和特殊医用食品。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：本专利技术提供一种源于南极磷虾的降压三肽，含有氨基酸序列为Phe-Ala-Ser的降压三肽。本专利技术所提供的南极磷虾降血压三肽Phe-Ala-Ser(FAS)对其ACE具有显著抑制作用，半数抑制浓度(IC50)为0.152mg/mL，Phe-Ala-Ser(FAS)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作用的功能性评价结果表明：在100-500μM浓度下，Phe-Ala-Ser(FAS)对于HUVEC细胞无明显毒性作用，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子(NO)的释放，抑制内皮素(ET-1)的生成。因此，Phe-Ala-Ser(FAS)对ACE和HUVEC细胞作用的结果说明其具有良好的活性，可作为发展前景较好的降血压肽段应用于降血压药品、保健产品和特殊医用食品。作为优选，肽的ESI-MS测定分子量为323.35Da。作为优选，降压三肽选自如下的一种或多种修饰：(I)N-末端帽；(II)C-末端帽；(III)磷酸化；(IV)糖基化；和(V)一种或多种非基因编码的氨基酸。作为优选，降压三肽是通过下列阶段制备而成，(a)对南极磷虾进行匀浆的阶段；(b)将所述匀浆加入蒸馏水和蛋白酶后，在45～55℃的环境中水酶解5.5～6.5h制备南极磷虾酶解液的阶段；(c)将所述南极磷虾酶解液经超滤、阴离子交换层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，制备降压三肽的阶段；其中，匀浆采取间歇式超高压匀浆，具体方法为：在压力为165-175MPa的条件下均质20-40s，然后保压60-80s，泄压后重复1-4次相同的高压处理；降压三肽占整体南极磷虾酶解液的20～70wt％。超高压压力、均质时间、保压时间之间有着明显交互作用，且与匀浆速率、平均匀浆能耗以及匀浆液之间存在二次非线性关系，本实施例的间歇式超高压匀浆能够严重破坏鱼鳔的完整性，然后在泄压的过程中使得细胞内的内容物质如蛋白质等快速释放出来，随后在继续升压及超高压的条件下继续作用于蛋白质的性质十分稳定的三股超螺旋结构，破坏氢键，进而使得蛋白质特定的空间构象被改变为无序的松散的伸展状结构，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，提高后续酶解过程中碱性蛋白酶和蛋白质的接触机会，如此反复，能够最大化的提高降血脂六肽的产率，且能耗低。为了优化技术方案，采取的措施还包括：步骤(b)中的蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥2.0×105U/g。步骤(c)中阴离子交换层析的具体步骤为：将超滤酶解液用Tris-Hcl缓冲溶液配成浓度为55～65mg/mL的溶液，离心，上清液按照体积比1mL:20～25mL加入到QFF阴离子交换层析柱中，用Tris-HCl缓冲液、0.1mol/LNaCl溶液、0.5mol/LNaCl溶液、1mol/LNaCl溶液分别进行洗脱，流速为3mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血压活性最强组分为离子交换层析酶解物。步骤(c)中凝胶柱层析的具体步骤为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，离心，上清液按照体积比1mL:15～20mL加入到葡聚糖凝胶SephadexG-15层析柱中，用超纯水进行洗脱，流速为0.5～0.8mL/min，洗脱液于280nm检测，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，降血压活性最强组分为凝胶层析酶解物。步骤(c)中反相高效液相色谱纯化的具体步骤为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～55μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据各组分降血压活性筛选获得降血压三肽Phe-Ala-Ser(FAS)；RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：30％乙腈；洗脱速度0.6～1.0mL/min；紫外检测波长280nm。本专利技术还提供了一种源于南极磷虾的降压三肽在制备用于治疗高血压前期或高血压的降血压药物和/或保健产品和/或特殊医用食品的应用。本专利技术还提供了一种源于南极磷虾的降压三肽在生产用于预防和/或治疗由血管紧张素转化酶异常引起的疾病的药剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所提供的南极磷虾降血压三肽Phe-Ala-Ser(FAS)对其ACE具有显著抑制作用，半数抑制浓度(IC50)为0.152mg/mL。Phe-Ala-Ser(FAS)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作用的功能性评价结果表明：在100-500μM浓度下，Phe-Ala-Ser(FAS)对于HUVEC细胞无明显毒性作用，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子(NO)的释放，抑制内皮素(ET-1)的生成。因此，Ph本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：含有氨基酸序列为Phe‑Ala‑Ser的降压三肽。

【技术特征摘要】
1.一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：含有氨基酸序列为Phe-Ala-Ser的降压三肽。2.根据权利要求1所述的一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：所述肽的ESI-MS测定分子量为323.35Da。3.根据权利要求1所述的一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：所述降压三肽选自如下的一种或多种修饰：(I)N-末端帽；(II)C-末端帽；(III)磷酸化；(IV)糖基化；和(V)一种或多种非基因编码的氨基酸。4.根据权利要求1或2所述的一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：所述降压三肽是通过下列阶段制备而成，(a)对南极磷虾进行匀浆的阶段；(b)将所述匀浆加入蒸馏水和蛋白酶后，在45～55℃的环境中水酶解5.5～6.5h制备南极磷虾酶解液的阶段；(c)将所述南极磷虾酶解液经超滤、阴离子交换层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，制备降压三肽的阶段；其中，匀浆采取间歇式超高压匀浆，具体方法为：在压力为165-175MPa的条件下均质20-40s，然后保压60-80s，泄压后重复1-4次相同的高压处理。5.根据权利要求4所述的一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：所述步骤(b)中的蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥2.0×105U/g。6.根据权利要求4所述的一种源于南极磷虾的降压三肽，其特征在于：所述步骤(c)中阴离子交换层析的具体步骤为：将超滤酶解液用Tris-Hcl缓冲溶液配成浓度为55～65mg/mL的溶液，离心，上清液按照体积比1mL:20～25mL加入到QFF阴离子交换层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，陶静，赵玉勤，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33