具有ACE抑制活性的三肽制造技术

本发明专利技术主要涉及具有ACE抑制活性的三肽，肽序列分别为WGK和FQK，属于生物技术领域。本发明专利技术借助在线数据库，通过对蛋白质虚拟酶解，预测活性肽潜在活性、水溶性、ADMET(吸收、代谢和毒性)性质，并经分子对接等多轮筛选，利用高效液相色谱法验证体外ACE抑制活性后得到两种具有抑制ACE活性的三肽。本发明专利技术涉及的两种活性肽其序列短，安全且易于获得。

【技术实现步骤摘要】
具有ACE抑制活性的三肽
本专利技术属于生物
，主要涉及具有ACE抑制活性的三肽。
技术介绍
血管紧张素转化酶(Antiotensin-IConvertingEnzyme，ACE，EC3.4.15.1)是一种含锌的二肽羧酶，能被氯离子激活，并具有较宽的底物特异性。ACE对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用。抑制ACE的活性被认为是治疗高血压的一种重要而有效的方法。实验证明，一些食物蛋白质来源的ACE抑制肽无毒副作用，安全性极高，且对血压正常者无降血压作用。随着生物信息学的发展以及生物活性肽研究的深入，越来越多蛋白质的一级结构及活性肽的氨基酸序列得到了阐明，蛋白酶的酶切位点也越来越明确。为从原料蛋白质中寻找未知序列的生物活性肽提供了基础，并提供了科学的依据。更多的蛋白质三维结构被确证，产生的大量蛋白已经被选做潜在治疗靶标进行研究，因而拓展了分子对接技术和虚拟筛选方法在小分子设计开发中的应用范围。针对食源性生物活性肽的虚拟筛选方法是一种有效的研究手段，是依靠计算机的辅助作用来筛选具有潜在生物活性氨基酸序列的关键技术。利用在线数据，不仅减少筛选强度和缩短研发周期，还提高了筛选成功的概率。将这种方法运用在ACE抑制肽基于分子对接技术的虚拟筛选方法中，能够大量节省研究成本而且有效地缩小了鉴定ACE抑制肽的周期。在传统获得ACE抑制肽的方法中，食源性蛋白酶解产物组分复杂，含有成百至上千条肽段，而且分子量相近或电荷相等的肽段难以进行分离纯化，对于后续的结构鉴定带来了巨大的难题。不仅要花费大量时间用来分离纯化，而且难以得到高纯度、单一的物质，虚拟筛选的应用可以有效解决ACE抑制肽在筛选过程中面临的难题。
技术实现思路
本专利技术通过利用生物信息学的方法，借助在线活性肽数据库，利用活性肽的分子量、生物活性评分、水溶性、ADMET(吸收、代谢和毒性)等性质进行多轮筛选，结合分子对接得到与ACE(PDBID：1O86)稳定结合的两种生物活性肽，并通过高效液相色谱法证实其体外ACE抑制活性，其三肽序列分别为WGK和FQK，对应IC50值分别为222.74μM和250μM。最后利用分子对接软件，阐明ACE-WGK和ACE-FQK相互作用与结合位点。本专利技术的技术方案：具有ACE抑制活性的三肽，其氨基酸序列分别为WGK和FQK。所述三肽来自鸡蛋蛋白，包括以所述ACE抑制活性的肽序列为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰。所述ACE-WGK催化位点的氨基酸残基分别为Gln281，Tyr520，His353，His513，Tyr523，Glu384和Lys511。ACE-FQK催化位点的氨基酸残基分别为Ala354，His353，His513，Tyr523，Tyr520和Lys511。本专利技术中所涉及的各项实验方法具体如下：1、原料蛋白的筛选和评估从NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)数据库中搜寻鸡蛋蛋白相关的蛋白质序列进行分析，选定依据为鸡蛋蛋白的重要组分且亲本蛋白质的序列信息的可用性。根据“潜在生物活性谱”工具，使用BIOPEP-UWM(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)分析鸡蛋蛋白序列。在该过程中，将释放的鸡蛋蛋白活性肽与已报到的肽序列进行比较，所述肽序列表现出高的ACE抑制能力。鸡蛋蛋白质的这些ACE抑制肽片段的频率表明这些鸡蛋蛋白质作为ACE抑制肽候选物的潜力。2、虚拟筛选ACE抑制肽使用胃蛋白酶(pH1.3)和胰蛋白酶通过ExPASyPeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)对鸡蛋蛋白进行虚拟水解，选出所有的三肽，在PeptideRanker(http：//bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/Peptideranker.php)中进行活性评分，选定评分高的三肽，使用在线工具Innovagen(http：//www.innovagen.com/proteomics-tools)和admetSAR(http：//lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/redict/)分别预测水溶性和ADMET(吸收、代谢和毒性)性质。筛选得到的活性肽在DiscoveryStudio2017R2Client软件中与ACE(PDBID：1O86)进行分子对接，选定与ACE结合稳定的三肽进行固相化学合成。3、采用高效液相色谱法验证活性肽的体外ACE抑制活性取马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)底物溶液，加入抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴中预热3～5min，然后加入ACE液充分混合，37℃保温30min后，再加入的1mol/LHCl终止反应，得到反应液。同时用硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈∶水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。本专利技术的活性三肽WGK和FQK对ACE均有显著抑制作用，其IC50分别为222.74和250μM。因此，所述的三肽WGK和FQK具有体外ACE抑制活性。4、分子对接预测ACE与活性肽相互作用利用DiscoveryStudio2017R2Client软件进行ACE与三肽的分子对接，其中，ACE(PDBID：1O86，Resolution：)的晶体结构是从RCSBProteinDataBank(https：//www.rcsb.org/)获得，活性肽的3D结构使用CHARMm力场进行最小化，并且采用稳定的能量构象进行对接研究。使用Discoverystudio2017R2Client软件的CDOCKER模块在半柔性结合位点进行分子对接。对接运行以坐标x：40.4974，y：34.8829，z：44.3814，对接半径为根据所得到的对接数据，计算出的ACE-WGK和ACE-FQK的CDOCKER能量。本专利技术的积极有益效果：(1)依据本专利技术所述的氨基酸序列，可通过化学合成法获得本专利技术所述的ACE抑制肽(WGK和FQK)。(2)本专利技术通过计算机辅助设计技术来进行定向结合多肽的虚拟筛选，在节省纯化、鉴定肽序列的时间和成本的前提下，缩小了在生物活性测定中实际测试的化合物的数量，提高了筛选成功的机率。(3)经过在线数据库BIOPEP-IUM(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)和AHTPDB(http：//crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/)的搜索，本专利技术所涉及的两种具有ACE抑制活性的三肽为新的食源性ACE抑制肽序列。附图说明本专利技术附图2幅，其中：图1ACE-WGK(PDBID：1O86)分子对接图谱；图2ACE-FQK(PDBID：1O86)分子对接图谱。具体实施方式下面以具体实施例的方式对本专利技术作进一步的阐述。实施例1原料的筛选和评估从NCBI数据库中搜寻鸡蛋蛋白相关的蛋白质序列进行分析，选定依据为鸡蛋蛋白的重要组分且亲本蛋白质的序列信息的可用性。最终选定蛋白卵清蛋白(Acc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有ACE抑制活性的三肽，其特征是，所述三肽的氨基酸序列分别为WGK和FQK。

【技术特征摘要】
1.具有ACE抑制活性的三肽，其特征是，所述三肽的氨基酸序列分别为WGK和FQK。2.如权利要求1所述的具有ACE抑制活性的三肽，其特征是，WQK与ACE(PDBID：1O86)相互作用涉及的催化位点的氨基酸残基分别为Gln281，Tyr520，His353，His513，Tyr523，Glu384和Lys511；FQK...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志鹏，樊玥，赵文竹，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21