本发明专利技术提供了一种高灵敏液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备方法。试剂盒由特定浓度的标准曲线干血滤纸片、质控样本干血滤纸片、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。干血滤纸片打孔取样，先用硫酸锌溶液处理，以子囊霉素为内标，用乙腈沉淀，采用C18键合相硅胶为固定相，以乙腈‑1mM乙酸铵为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测，离子选择通道分别为m/z 821.4→m/z 768.4(他克莫司)和m/z 809.6→m/z 756.7(内标子囊霉素)。本发明专利技术的试剂盒，测试灵敏度可达到1.0ng/ml，各项方法学指标均可满足干血滤纸片中他克莫司血药浓度监测的需要。
A Kit for Quantitative Determination of Tacrolimus in Dry Blood Filter Paper by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Its Preparation
The invention provides a high sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry kit for quantifying tacrolimus in dry blood filter paper and a preparation method thereof. The kit consists of standard curve dried blood filter paper of specific concentration, quality control sample dried blood filter paper, sample treatment liquid, internal standard liquid and mobile phase regulating liquid. Dry blood filter paper was punched and sampled with zinc sulfate solution, ascomycin as internal standard, acetonitrile precipitation, C18 bonded phase silica gel as stationary phase, acetonitrile 1mM ammonium acetate as mobile phase for gradient separation, and mass spectrometer for quantitative detection. Ion selective channels were m/z 821.4 m/z 768.4 (tacrolimus) and m/z 809.6 m/z 756.7 (internal standard). Cystomycin. The test sensitivity of the kit can reach 1.0ng/ml, and the methodological indexes can meet the need of monitoring tacrolimus blood concentration in dry blood filter paper.
【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备
本专利技术涉及一种基于干血滤纸片和液相色谱串联质谱技术开发的干血滤纸片中他克莫司定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱质谱技术对干血滤纸片中他克莫司进行准确定量检测的方法。本专利技术还涉及本专利技术试剂盒的生产方法和应用。
技术介绍
他克莫司(tacrolimus，简称FK506)是从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯类新型免疫抑制剂，能有效抑制T淋巴细胞激活。FK506与内源性细胞受体结合，形成一个亲免素复合物，从而发挥药理作用。目前FK506已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗。FK506的血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关，不仅治疗窗窄而且药动学个体差异大，临床使用FK506需要进行全血药浓度监测。目前临床常规监测FK506全血浓度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫发光技术(microparticleenzymeimmunoassay，MEIA)、酶联吸附免疫分析技术(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和液相色谱质谱技术(LC-MS/MS)。ELISA法和MEIA法对体内FK506及其代谢产物产生交叉免疫反应，使实际测得结果为FK506及其代谢物之和。LC-MS/MS是近年来迅速发展的定量分析技术，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内药物分析、治疗药物监测、新生儿遗传疾病筛查和药物代谢研究等领域的实用方法。肝、肾、心、胰等器官移植和自身免疫系统相关疾病的患者分布全国各地，尤其以农村、中小城市为主，大多数患者需要终身服药并进行浓度定量监测。而能够开展FK506全血浓度的定量监测的机构主要在大中型城市的三级医院和医疗检验所，长期监测FK506浓度存在困难。采用干血滤纸片(Driedbloodspot，DBS)进行全血样品收集，以LC-MS/MS技术进行浓度定量，能够很好的解决FK506全血样品运输成本和稳定性问题，真正实现异地检测。DBS即将全血样品收集在卡纸上，从样本保存的角度上来说，干血斑比全血更为稳定，其储存及运输成本远低于全血，干血滤纸片需要采集的样本量较少，在需要多次采样来进行诊断的检测中有着特定的优势。由于干血滤纸片的简易性和较高的稳定性，在许多大规模疾病筛查中(如新生儿的遗传病筛查)已经显现出来了极为广泛的应用前景。国外已经广泛将干血滤纸片应用于疾病筛查样本运输中，在一定程度上替代了传统的全血的运输方式。国内也逐渐开始使用干血滤纸片进行血液制品的运输，多家医院已经使用干血滤纸片运输血样进行艾滋病(HIV)、丙型肝炎、糖原贮积病如庞贝病等疾病筛查。DBS用于LC-MS/MS定量FK506未见报道。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的LC-MS/MS定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒，使其能广泛应用于我国FK506常规血药浓度监测中，能够解决农村和中小城市患者FK506监测成本和稳定性问题，真正实现异地检测，也将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于干血滤纸片和液相色谱串联质谱技术开发的干血滤纸片中他克莫司定量检测试剂盒，以满足他克莫司血药浓度监测的需要。本专利技术的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。1)技术方案本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定人干血滤纸片样本中FK506浓度的新型试剂盒。试剂盒以子囊霉素为内标，用硫酸锌溶液和乙腈对干血滤纸片样本进行萃取前处理，取上清液进行LC-MS/MS检测，记录FK506和内标的峰面积。采用内标法，根据待测样本中的FK506/内标峰面积比值即可计算出FK506浓度。测定结果为制作干血滤片的全血样本中FK506浓度。本专利技术的试剂盒制备过程包括如下步骤：a)他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制：精密称取10mg他克莫司对照品，置10mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成1.0mg·mL-1的他克莫司储备液。精密量取他克莫司储备液0.25mL，置50mL容量瓶中，加全血(使用EDTA或ACD抗凝剂，避免使用肝素)稀释至刻度，配制成5μg·mL-1的他克莫司母液。分别精密量取他克莫司母液0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5mL，分别置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司标准曲线样本浓度分别为0、1、3、10、30、50ng·mL-1，分装，贴签标记，完成操作。分别精密量取他克莫司母液0.025、0.1、0.4mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司质控样本浓度分别为2.5、10、40ng·mL-1，分装，贴签标记，完成操作。b)标准曲线干血滤纸片、质控样本干血滤纸片的制备：使用移液枪或毛细管分别移取标准曲线样本、质控样本，滴于不同的DBS上形成血班。在DBS卡的每个圈中滴一滴血，确保覆盖整个圈切完全渗透该滤纸。血滴仅滴在滤纸的一面，不要在同一滤纸圆圈中重复滴上血液。干燥时保持滤纸悬空，水平固定在桌面边缘，以保证充分干燥，注意使干血滤纸片远离直接的热源或日光。为了避免交叉污染，勿将卡片重叠放置。在血斑完全干燥后，在带干燥收集卡的干血滤纸片上作标记，使用塑封带将干燥收集卡进行封装，完成操作。c)样本处理液的配制：精密称取14.38gZnSO4·7H2O，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为100mmol·L-1硫酸锌溶液，分装，贴签标记，完成操作。d)内标液的配制：精密称取1mg子囊霉素对照品，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成20μg·mL-1的储备液，精密量取上述子囊霉素储备液1mL，置1000mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，即为20ng·mL-1子囊霉素溶液，分装，贴签标记，完成操作。e)流动相调节液的配制：精密称取38.5g乙酸铵，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为1mol·L-1乙酸铵溶液，分装，贴签标记，完成操作。2)本专利技术的试剂盒使用方法如下：使用打孔器将干血滤纸片打孔至1.5mLEP管中(半径6mm打孔器打1孔，半径3mm打孔器打3孔)，加入样本处理液20μL，再加入内标液60μL，涡流混匀1min，静置10min，涡流混匀1min，离心5min(12000rpm)，取上清液进样5μL进行LC-MS/MS定量分析。3)有益效果本专利技术试剂盒采用LC-MS/MS技术对干血滤纸片中FK506进行准确定量检测，检测结果为FK506原型药物浓度，能更准确的说明药物浓度-效疗-不良反应三者之前的关系。同时，本专利技术试剂盒首次实现LC-MS/MS法定量干血滤纸片中FK506浓度，能解决农村和中小城市患者FK506监测成本和稳定性问题，真正实现异地检测。附图说明图1他克莫司样本处理和检测过程图2他克莫司(A)和内标子囊霉素(B)[M+H]+的二级全扫描质谱图图3LC-MS/MS测定人全血中他克莫司和内标子囊霉素的典型离子流图A空白溶剂B空白全血干血滤纸片C标准曲线1.0ng·mL-1他克莫司干血滤纸片和20ng·mL-1内标子囊霉素D连续口服给予他克莫司胶囊2mg谷浓度干血滤纸片样本(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高灵敏液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备，其特征在于由特定浓度的标准曲线干血滤纸片、质控样本干血滤纸片、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。
【技术特征摘要】
1.一种高灵敏液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备，其特征在于由特定浓度的标准曲线干血滤纸片、质控样本干血滤纸片、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。2.根据权利1所述的液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制；(2)标准曲线干血滤纸片、质控样本干血滤纸片的制备；(3)样本处理液硫酸锌溶液的配制；(4)内标液子囊霉素的配制；(5)流动相调节液乙酸铵的配制。3.一种干血滤纸片中他克莫司定量检测方法，包括：(1)干血滤纸片样...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽宏，李鹏飞，
申请(专利权)人：刘丽宏，李鹏飞，
类型：发明
国别省市：北京,11
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