本发明专利技术公开了一种基于HPLC的α‑酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，该试剂盒包括由盐酸、EDTA和水组成的试剂一，由NaOH和水组成的试剂二，由盐酸苯肼和水组成的试剂三，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水组成的试剂四以及α‑酮戊二酸标准品；该方法原理为利用α‑酮戊二酸与衍生剂反应产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离后，用紫外检测器可测定α‑酮戊二酸的含量。本发明专利技术可检测到微克级别的含量，灵敏度高，本发明专利技术的样本前处理的过程简单易操作，节约人力，本发明专利技术的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低廉，且本发明专利技术相对于生物免疫检测方法，所需试剂的价格具有明显优势，且基本无毒，安全环保。
【技术实现步骤摘要】
一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法
本专利技术属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法（HPLC）的的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法。
技术介绍
α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，在循环中的位置位于异柠檬酸之后以及琥珀酰辅酶A之前。在这一部位，回补反应可以通过自谷氨酸的转氨基作用产生α-酮戊二酸，从而达到补充此中间代谢产物的目的。目前市面上已有的检测α-酮戊二酸的方法可分为三大类，分光法，生物免疫检测技术以及高效液相检测技术。分光法的原理是利用α-酮戊二酸的衍生物在特定波长下有吸收值进行大概的含量检测，一般极容易受到体系复杂杂质，色素等影响，含很容易出现测试含量偏高。生物免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长，价格昂贵。色谱技术近些年飞速发展，检测生物体内小分子的应用也越来越广泛，但是现在市面上缺少基于高效液相色谱法（HPLC）检测α-酮戊二酸的检测技术却鲜有报道，因此需要一种样品前处理便捷且损失率较高的高效液相色谱法α-酮戊二酸含量检测方法。
技术实现思路
为了满足上述需求，本专利技术旨在提供一种基于高效液相色谱法（HPLC）的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，具有检测灵敏度高，无毒性，操作简便，成本低廉，重复性较好等特点。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5mLEP管中，2-8℃保存。进一步的，所述试剂一中含有4mL盐酸、5mgEDTA以及76mL水。进一步的，所述试剂二中含有80mgNaOH以及10mL水。进一步的，所述试剂三中含有80mg盐酸苯肼以及10mL水。进一步的，所述试剂四中含有141.4mg磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。一种利用上述试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其测定原理为利用α-酮戊二酸与衍生剂反应，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，用紫外检测器可测定α-酮戊二酸的含量，其具体步骤如下：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；步骤2检测前的准备工作；溶剂的除杂：将800mL超纯水和500mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；流动相的配制：称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制成流动相；流动相的消泡：将配好的流动相超声30分钟，以脱去流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤3α-酮戊二酸的提取；称取约0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入EP管内，4℃浸提60min，采用10000g离心率，4℃离心10min，提取上清液；步骤4α-酮戊二酸的衍生反应；取250μL步骤3中提取到的上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，25℃下反应30min后，制得样品衍生物溶液，取样待测；步骤5α-酮戊二酸标准品溶液的配制；在试剂五中加入1mL纯水，配成500μg/mL母液，将母液用纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的α-酮戊二酸标准品溶液；将不同浓度的α-酮戊二酸标准品溶液均按照步骤4中的方法进行衍生反应，制得不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液后，分别取样并置于样品瓶内待测；步骤6α-酮戊二酸含量测定的操作步骤；开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；用制备好的流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样；在高效液相色谱仪中，分别加入不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液10μL，在走样时间内分离α-酮戊二酸衍生物，α-酮戊二酸衍生物的保留时间为30min，记录不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品的峰面积，用于计算标准曲线；在高效液相色谱仪中，加入样品衍生物溶液10μL，在相应保留时间处检测α-酮戊二酸衍生物的峰面积；步骤6α-酮戊二酸含量的计算：以标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算α-酮戊二酸标准曲线；将α-酮戊二酸衍生物的峰面积代入标准曲线，计算样品中α-酮戊二酸含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的检测方法需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，因此检测灵敏度高。2、本专利技术的检测方法对于样本的前处理，过程简单易操作，，可以节省人力。3、本专利技术的检测方法的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本较为低廉。4、本专利技术的检测方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，且每一个样品测试时间短，连续性较好。5.本专利技术的检测方法相对于生物免疫检测方法，所用到的试剂的价格具有明显优势，且所需试剂基本无毒，安全环保。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明。本专利技术的具体实施方式由以下实施例详细给出。具体实施方式下面将结合实施例，来详细说明本专利技术。一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：试剂一，液体80mL×1瓶，由4mL盐酸、5mgEDTA、76mL水混合而成；试剂二，液体10mL×1瓶，由80mgNaOH和10mL水混合而成；试剂三，液体10mL×1瓶，由80mg盐酸苯肼和10mL水混合而成；试剂四，液体10mL×1瓶，由141.4mg磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾和10mL水混合而成；试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5mLEP管中，2-8℃保存。一种利用上述试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其测定原理为利用α-酮戊二酸与衍生剂反应，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，用紫外检测器可测定α-酮戊二酸的含量，其具体步骤如下：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于HPLC的α‑酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；试剂五，α‑酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2‑8℃保存。
【技术特征摘要】
1.一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5mLEP管中，2-8℃保存。2.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有4mL盐酸、5mgEDTA以及76mL水。3.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有80mgNaOH以及10mL水。4.根据权利要求3所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有80mg盐酸苯肼以及10mL水。5.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有141.4mg磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。6.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；步骤2检测前的准备工作；溶剂的除杂：将800mL超纯水和500mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；流动相的配制：称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制...
【专利技术属性】
技术研发人员：王黔，李彩红，赵林川，
申请(专利权)人：苏州科铭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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