一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法，将样品溶液稀释后与含有NADH、PLP、乙醇脱氢酶和DTT的溶液混匀反应后，再与含有LTA的溶液反应，通过检测计算OD340降低速率，与标准曲线进行比较获得苏氨酸的含量。本发明专利技术的方法，可简单、快速且准确地检测发酵液中苏氨酸的含量，检测通量高、费用低、时间短、误差小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工业，特别涉及利用基因工程改造的工业微生物生产L-苏氨 酸的领域，具体涉及。
技术介绍
目前工业上多采用发酵法生产苏氨酸。欧美国家的苏氨酸生产水平要明显高于 我国，如德国的德固赛公司、美国的ADM公司等应用先进的分子操作技术对菌种进行改造， 使苏氨酸的产量及转化率有了巨大的提高。目前国际菌种发酵水平为150g/L，发酵周期为 36_48h，转化率高于50%。国内无论是发酵产量还是转化率均低于国际水平。 苏氨酸高产菌的获得，一方面是采用基因工程的手段对菌株进行理性改造，另一 方面是通过物理诱变或者化学诱变后筛选产量提高的菌株，并且后者为获得高产菌株的一 种重要手段。 发酵液中苏氨酸的检测是筛选过程中主要的瓶颈之一。目前在检测发酵液中苏氨 酸含量时，主要包括纸层析法和高校液相色谱等。纸层析法使用设备较少，成本低廉，但是 每次测量需要3-4小时，并且准确率比较低，误差可达10%左右，因此不能迅速的提供指导 实验的数据。高效液相色谱可以提供精确的实验结果，但是该方法所采用的仪器昂贵，不能 广泛推广。 另外，测定苏氨酸含量的方法还包括高氯酸电位滴定法，此法只能局限于测定固 定样品，不能进行发酵液中苏氨酸含量的测定。 因此，本领域尚需开发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够简单、快速、准确的检测发酵液中苏氨酸含量的 方法。 本专利技术的第一方面，提供一种检测样品中苏氨酸含量的方法，所述方法包括以下 步骤： (i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液； (ii)将所述第一混合溶液置于4土 rc放置10-90min后恢复温度至15-30°c ; (iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液； (iv)检测所述第二混合溶液的OD34。，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次； (V)以检测时间和对应的OD34。作图，计算斜率即为样品的OD34。降低速率； (Vi)将计算得到的OD34。的降低速率与标准曲线进行比较，得到所述发酵液中苏 氨酸含量， 其中，所述第一反应溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、DTT和水； 所述第一混合溶液中含有 10-500mM HEPES buf f er、100 μ M-1000 μ M NADH、 10 μ Μ-100 μ M PLP、1U-50U 乙醇脱氢酶和 0· DTT ; 所述第二反应溶液中含有1-20U LTA，余量为水。 在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-400mM HEPES buffer、100yM~ 800 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~35U 乙醇脱氢酶和 0· 5mM ~5mM DTT。 在另一优选例中，在步骤（i)中将样品稀释后与所述第一反应溶液混合均匀，稀 释后的样品中苏氨酸的浓度为0. 1-lOmM。 在另一优选例中，稀释后的样品与第一反应溶液的体积比为1:1-5。 在另一优选例中，所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体积比为1-5:1。 在另一优选例中，通过以下步骤获得所述标准曲线： (a)将浓度范围为0.1 mM~8mM的数个浓度不同的标准苏氨酸溶液分别与第一反 应溶液混合均匀，得到第一混合溶液； (b)将所述第一混合溶液置于4土 1°C放置10_90min后恢复温度至15-30°C ; (c)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液； ⑷检测所述第二混合溶液的OD34。，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次； (e)以测定时间和对应的OD34。为坐标作图，计算斜率为OD34。降低速率； (f)以标准苏氨酸溶液的浓度及对应的OD34。降低速率为坐标，绘制得到所述标准 曲线， 其中，步骤（a)中所述第一反应溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、 DTT和水； 步骤（a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、 100 μ Μ-1000 μ M NADH、10 μ Μ-100 μ M PLP、1U-50U 乙醇脱氢酶和 0· DTT ; 所述第二反应溶液中含有1-20U LTA，余量为水。 在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-400mM HEPES buffer、100yM~ 800 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~35U 乙醇脱氢酶和 0· 5mM ~5mM DTT。 在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-200mM HEPES buffer、100yM~ 500 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~5U 乙醇脱氢酶和 0· 5mM ~I. 5mM DTT。 在另一优选例中，所述步骤b)中标准苏氨酸溶液与第一反应溶液的体积比为 1:1-5 ;和 / 或 所述步骤d)中所述第一混合溶液与第二反应溶液的体积比为1-5:1。 在另一优选例中，所述检测样本中苏氨酸含量与所述标准曲线的建立同时进行。 在另一优选例中，所述LTA来源于铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒 酵母、假丝酵母、念珠菌中的一种或两种以上。 在另一优选例中，步骤（a)配制8个浓度不同的标准苏氨酸溶液，浓度分别为 0. 2mM、0. 5mM、lmM、2mM、3mM、4：mM、5mM、6mM。 本专利技术的检测方法，可以简单、快速、准确地检测发酵液中苏氨酸含量，克服现有 技术中设备昂贵，操作繁琐，测量耗时等不足。 应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。【附图说明】 图1为实施例1检测结果图。 图2为实施例3的检测结果图。 图3为苏氨酸浓度与NADH降低速率曲线。 图4为双酶法检测苏氨酸含量的线性范围。 图5为M9+酵母粉培养基中苏氨酸含量及NADH降低速率曲线。 图6为LB培养基中苏氨酸含量及NADH降低速率曲线。 图7为采用本专利技术方法（酶偶联法）和HPLC方法检测苏氨酸含量结果图，各时间 点处第一柱（左柱）为HPLC检测结果，第二柱（右柱）为本专利技术酶偶联法检测结果。【具体实施方式】 本申请的专利技术人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种快速检测发苏氨酸 含量的方法，以LTA酶作为工具酶并将NADH的降低速率与苏氨酸的产量相偶联。L-苏氨 酸酸缩酶（L-threonine aldolase, LTA)能催化L-苏氨酸生成甘氨酸和乙酸及其逆反应， 在LTA及吡哆醛磷酸盐（PLP)存在时，苏氨酸会被分解为乙醛和甘氨酸，乙醛被乙醇脱氢 酶（ADH)还原为乙醇，同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)被氧化为NAD +,通过0D34(]nm检测 NADH的变化速率确定苏氨酸的含量。在此基础上，完成了本专利技术。 检测方法 本专利技术提供的检测样品中苏氨酸含量的方法，包括以下步骤： (i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液； (ii)将所述第一混合溶液置于4土 1°C放置10_90min后恢复温度至15_30°C ; (iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液； (i本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中苏氨酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；(ii)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10‑90min后恢复温度至15‑30℃；(iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；(iv)检测所述第二混合溶液的OD340，每隔1‑5分钟检测一次，共检测5‑7次；(v)以检测时间和对应的OD340作图，计算斜率即为样品的OD340降低速率；(vi)将计算得到的OD340的降低速率与标准曲线进行比较，得到所述发酵液中苏氨酸含量，其中，所述第一反应溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、DTT和水；所述第一混合溶液中含有10‑500mM HEPES buffer、100μM‑1000μM NADH、10μM‑100μM PLP、1U‑50U乙醇脱氢酶和0.5mM‑8mM DTT；所述第二反应溶液中含有1‑20U LTA，余量为水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，刘永飞，李斐然，姜文侠，张笑然，郑平，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12