一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，它包括分离单菌落、制备单菌落甘油管、筛选单菌落菌种、制备单菌落冷冻菌等步骤，在分离纯化过程中的单菌落甘油孢子悬液分装于3支甘油管，其中2支单菌落甘油管分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，另外1支单菌落甘油管直接用于单菌落冷冻菌的制备。此过程减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，提高了灰黄霉素的发酵单位；减少和减慢了菌种分生孢子在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证了菌种生长繁殖和发酵效价的稳定，简化了菌种制备过程中的许多无菌操作环节，从而大大降低了菌种的染菌率。

Preparation of a single colony frozen bacterium of griseofulvin

The invention discloses a preparation method of griseofulvin single-colony freezing bacteria, which comprises the steps of isolating single-colony, preparing single-colony glycerol tube, screening single-colony bacteria, preparing single-colony freezing bacteria, etc. During the separation and purification process, the single-colony glycerol spore suspension is separated into three glycerol tubes, of which two single-colony glycerol tubes are used for shaking flask screening and shaking flask re re-screening respectively, and another single-colony glycerol suspension is Colony glycerol tube is directly used for the preparation of single colony frozen bacteria. This process reduces the number of passages of strains in the process of rejuvenation breeding and preparation, improves the fermentation unit of griseofulvin, reduces and slows down the mortality and death rate of conidia in the process of preservation, ensures the stability of growth and reproduction of strains and fermentation potency, simplifies many aseptic operation links in the process of preparation of strains, thus greatly reduces the strains. The rate of bacterial infection.

【技术实现步骤摘要】
一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法
本专利技术属于菌种培养
，尤其是一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法。
技术介绍
灰黄霉素(Griseofulvin)属芳香族衍生物类抗生素，它是一种抗真菌抗生素，在临床上被用于治疗皮肤癣菌属引起的感染，在农业上被用于抗植物真菌病。灰黄霉素产品的市场前景广阔。灰黄霉素菌种是由野生型Penicilliumpatulum4541菌株经人工诱变而来的D-756菌种的后代，该菌种主要是以野生型菌种为出发菌，采用紫外照射和LiCl为诱变剂而选育出来的高产菌种。菌种在长时间的保存和传代过程中，极易发生菌种退化，尤其是诱变菌种。因此，要使菌种保持其优良性状，菌种的分离和制备方法尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，该方法优化了菌种选育过程，减少菌种传代次数，防止菌种退化，保持菌种优良性状；减少菌种在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证菌种发酵效价的稳定性。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1，分离单菌落：取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-5、10-6、10-7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；S2，制备单菌落甘油管：取步骤S1培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的试管中，振荡打下孢子，再加1.5～2.5ml的8～12％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱保藏；S3，筛选单菌落菌种：取步骤S2制备的相同单菌落编号的两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；S4，制备单菌落冷冻菌：将步骤S3筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养6～7天成熟后，加入适量灭菌的8～12％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸10～20ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。优选的，步骤S1所述的平板培养基按如下重量百分比配制：籼米粉2～4％、蔗糖2～4％、磷酸二氢钾0.4～0.6％、氯化钾0.3～0.5％、氯化钠0.1～0.3％、硫酸镁0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2～3％和余量水。优选的，步骤S1所述的平板培养基按如下重量百分比配制：籼米粉3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钾0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2.5％和余量水。优选的，本专利技术的方法还包括杂菌检验步骤，抽取S4步骤制备的灰黄霉素单菌落冷冻菌做无菌检查，抽取方法：小于10支，随机抽取1支冷冻菌；10～20支，随机抽取2支；20～30支，随机抽取3支；30支以上的按10％进行随机抽取，肉汤培养检验无杂菌后，方可使用。本专利技术和现有技术相比的优点为：本专利技术分离纯化过程中的单菌落甘油孢子悬液分装于3支甘油管，其中2支单菌落甘油管分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，另外1支单菌落甘油管直接用于单菌落冷冻菌的制备。此过程减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，提高了灰黄霉素的发酵效价；减少和减慢了菌种分生孢子在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证了菌种生长繁殖和发酵效价的稳定，简化了菌种制备过程中的许多无菌操作环节，从而大大降低了菌种的染菌率。本专利技术的方法优化了菌种选育过程，减少菌种传代次数，防止菌种退化，保持菌种优良性状，保证菌种发酵效价稳定性。具体实施方式为使本专利技术的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述。实施例1：一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，配制平板培养基：按重量百分比计，由籼米粉3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钾0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2.5％和余量水配制平板培养基；S2，分离单菌落：取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-5、10-6、10-7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到步骤S1配制的平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；S3，制备单菌落甘油管：取步骤S2培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的18×180mm试管中，振荡打下孢子，再加2ml的10％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱保藏；S4，筛选单菌落菌种：取步骤S3制备的相同单菌落编号两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；S5，制备单菌落冷冻菌：将步骤S4筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养7天成熟后，加入适量灭菌的10％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸15ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。S6，杂菌检验：抽取灰黄霉素单菌落冷冻菌做无菌检查，抽取方法：小于10支，随机抽取1支冷冻菌；10～20支，随机抽取2支；20～30支，随机抽取3支；30支以上的按10％进行随机抽取，肉汤培养检验无杂菌后，方可使用。实施例2：其它步骤与实施例1相同，不同之处在于配制平板培养基，本实施例平板培养基，按重量百分比计，由籼米粉2％、蔗糖4％、磷酸二氢钾0.6％、氯化钾0.3％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸亚铁0.001％、琼脂3％和余量水配制。实施例3：其它步骤与实施例1相同，不同之处在于配制平板培养基，本实施例平板培养基，按重量百分比计，由籼米粉4％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.4％、氯化钾0.5％、氯化钠0.3％、硫酸镁0.06％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2％和余量水配制。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1，分离单菌落：取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10‑5、10‑6、10‑7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；S2，制备单菌落甘油管：取步骤S1培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的试管中，振荡打下孢子，再加1.5～2.5ml的8～12％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用‑70℃丙酮预冻后放入‑70℃的超低温冰箱保藏；S3，筛选单菌落菌种：取步骤S2制备的相同单菌落编号的两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；S4，制备单菌落冷冻菌：将步骤S3筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养6～7天成熟后，加入适量灭菌的8～12％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸10～20ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用‑70℃丙酮预冻后放入‑70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。...

【技术特征摘要】
1.一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1，分离单菌落：取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-5、10-6、10-7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；S2，制备单菌落甘油管：取步骤S1培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的试管中，振荡打下孢子，再加1.5～2.5ml的8～12％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱保藏；S3，筛选单菌落菌种：取步骤S2制备的相同单菌落编号的两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；S4，制备单菌落冷冻菌：将步骤S3筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养6～7天成熟后，加入适量灭菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹凤娟，张国银，胡建华，丛立双，付桂杰，张红玉，高峰，
申请(专利权)人：赤峰制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15