一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法技术

本申请公开了一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，方法包括：对玫烟色棒束孢WSWL21837菌株进行活化、制备一级液体菌种、制备二级液体菌种、进行固体发酵培养、对孢子粉进行干燥与收集。本发明专利技术提供的技术方案，采用液‑固双相发酵培养技术，以1/4萨氏培养液为液体发酵培养基质，以麦麸为固相发酵培养产孢基质，以食用菌单口菌种袋为发酵产孢容器，该方法操作简作，菌株液相和固相培养生长快，产孢量大，孢子含量高，孢子萌发率高，全部发酵培养周期在20天左右，可在玫烟色棒束孢分生孢子粉的规模生产中应用，从而为害虫生防玫烟色棒束孢制剂的开发提供技术保障。

A Method for Producing Spore Powder of Corynebacterium fumigatus WSWL21837 Strain

This application discloses a method for producing spore powder of Corynebacterium fumigatus WSWL21837 strain. The method includes activation of Corynebacterium fumigatus WSWL21837 strain, preparation of first-class liquid strain, preparation of second-class liquid strain, solid fermentation culture, drying and collection of spore powder. The technical scheme provided by the invention adopts liquid-solid two-phase fermentation culture technology, uses 1/4 Saxhlet culture medium as liquid fermentation culture medium, wheat bran as solid-phase fermentation culture spore-producing medium, and edible fungi single-mouthed strain bag as fermentation spore-producing container. The method has simple operation, fast growth of strain liquid-phase and solid-phase culture, large spore production, high spore content, high spore germination rate and full germination. The fermentation culture period is about 20 days, which can be used in the large-scale production of conidia powder of Corynebacterium fumigatus, thus providing technical support for the development of biocontrol agent of pests against Corynebacterium fumigatus.

【技术实现步骤摘要】
一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法
本申请属于微生物
，具体地说，涉及一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法。
技术介绍
玫烟色棒束孢(IsariafumosoroseaWize)是一种重要的虫生真菌，属子囊菌亚门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，虫草菌科(Cordycipitaceae)，棒束孢属(Isaria)。该菌分布广，广泛存在于热带、亚热带和温带地区，而且致病力强，易培养且对人及环境无毒，不易产生抗药性等特点，长期以来是害虫综合防治措施研究和筛选中的重要内容。目前该菌种作为一种重要的生防真菌，已用于防治同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目等多种害虫。随着生物防治的日益发展，病原微生物的生产规模向制剂化及其商业化方向发展。用于商品化的真菌制剂多数以分生孢子作为害虫的感染源，但是不同地理环境条件及不同寄主来源的昆虫病原真菌菌株具有一定的地理特异性及寄主专化性，导致其产孢量与致病性均存在明显差异，直接影响其杀虫效果。因此，筛选适合的产孢条件是昆虫病原真菌菌株筛选及利用的基础和保障。目前的研究中，有关玫烟色棒束孢在实验室内培养及产孢研究有相关研究报道，但对于规模化产孢技术尚未见研究报道。虫生真菌作为一类重要的天敌生物资源，因其选择性高、寄主范围广、安全性好、对生态系统影响小、不易产生抗药性、易于生产、防治效果持久和稳定等诸多优点始终倍受人们的关注。就目前来看，虫生真菌在生产与应用方面仍存在一些问题：例如虫生真菌存在着菌种退化问题。如何维持优良菌株的特性，保持稳定的高产孢率和高毒力一直是工业生产中的关键。依靠自然筛选和诱变育种获得高毒力菌种资源已远远满足不了实际生产的需求，今后原生质体融合技术和基因工程技术将是遗传育种的方向之一。同时，应进一步研究菌种毒力退化机制，加强研究引起菌株变异的分子生物学和生物化学基础以及影响基因表达的因素，以进一步寻找保持菌株稳定性的有效途径；在其资源的开发上，存在着剂型单一，种类少的问题。由于害虫的种类繁多，各自的生物学特性不一，对环境的要求也不相同，同时虫生真菌的施用效果受环境中的温湿度影响较大，且防治效果较慢，制约了虫生真菌的大规模推广应用。因此，针对性地选择病原真菌进行防治是提高虫害防治效果的关键。而现有的虫生真菌种类和剂型仍然满足不了对防治不同地区不同害虫的需要；即使是目前最为先进的液固两相工艺，在孢子生产过程中也存在着规模小、机械化程度低、不易扩大生产、物耗浪费严重等诸多缺点，限制了真菌杀虫剂在科研与生产方面的发展，使虫生真菌以及其他微生物农药的生产难于产业化，大都只停留在作坊式的简单化生产水平上。以上这些问题相互影响，共同制约着虫生真菌的生产技术，使其难以推广与应用。
技术实现思路
本申请提供一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，用以克服现有玫烟色棒束孢固体发酵工艺中的不足，提供一种产孢量大、孢子含量高、孢子萌发率高的玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法。本申请公开的玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，包括以下步骤：步骤一、对玫烟色棒束孢WSWL21837菌株进行活化：采用萨氏培养基，于25±1℃、光照条件为16L:8D的培养箱中恒温培养15d；步骤二、制备一级液体菌种：采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，每5块菌饼置于100mL萨氏培养液中，然后置于25℃、光照条件为16L:8D、转速为200rpm/min的恒温摇床中培养3d，制得一级液体菌种，将每300mL菌液存放于容积为500mL的锥形瓶中；所述菌饼为利用直径为15mm的打孔器将经萨氏培养基活化后的菌落制成的直径为15mm，厚度为5mm的菌饼；步骤三、制备二级液体菌种：在摇床转速为100rpm/min条件下，采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，将制得的每5瓶一级液体菌种和200L萨氏培养液加入发酵罐中发酵，发酵温度环境在26-28℃之间，罐压在0.02-0.03Mpa之间；发酵的前16-24h保持摇床转速范围为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min；整个发酵过程培养3d，制得二级液体菌种；步骤四、进行固体发酵培养：采用无菌麦麸作为培养基质，无菌食用菌单口菌种袋作为产孢容器，以无盖塑料框作为乘载容器，无菌食用菌单口菌种袋的长、宽、高分别为：350mm、105mm、200mm，无盖塑料框的长、宽、高分别为350mm、250mm、100mm，每个菌种袋装固相麦麸基质0.5kg，采用液-固双相法，按照接种量固相麦麸基质：菌液＝1g：3.75mL的比例进行接种，之后平铺到塑料框中，放到培养架上进行培养，四周用经过灭菌处理的白色湿润棉布包围，保持相对湿度在90％以上、温度为25℃的密闭环境中培养3-4d；待菌丝长满整个培养基质且表面出现孢子后，将固体培养基反扣于培养架上进行开放式培养，在相对湿度为85％、温度为27℃的环境中继续培养4-5d，整个培养过程光照条件为L:D＝24:0；步骤五、对孢子粉进行干燥与收集：待固体培养基内、外部均布满玫烟色分生孢子后即停止产孢培养，将产孢盘置于30℃的温度环境中烘干处理72h，然后采用振荡筛收集孢子粉。如上所述的玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，其中，在步骤五后还包括：步骤六，对孢子粉质量进行评价：以每克固相麦麸基质产孢子粉的量、孢子粉含孢量、每克固相麦麸基质产孢数、孢子粉含水量、孢子萌发率作为评价指标，对孢子粉质量进行评价。如上所述的玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，其中，固相麦麸基质的制备方法为：将经20目筛子初筛后的麦麸在蒸馏水中浸泡，待其含水量达35％之后沥去多余水分，添加KNO3和食用油，每100g物料添加0.4gKNO3和5ml食用油，充分混匀后进行高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后即得待装入产孢容器的固相麦麸基质。本专利技术提供的玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法具有以下优点：1、本专利技术采用液-固双相法进行发酵生产玫烟色棒束孢WSWL21837的分生孢子，全部发酵培养周期在20天左右，收获的孢子粉产量与质量均非常高，能够为玫烟色棒束孢大规模生产提供依据，为其产业化应用奠定基础。2、本专利技术选用麦麸作为固体培养基质，在灭菌前首先进行初筛，选择20目的筛子去除麦麸中的细小杂质，其目的在于减少发酵过程中的污染来源；同时选择较大的麸皮，在孢子粉收集的时候可以避免细小杂质在孢子粉中的掺杂数量，以提高孢子粉纯度。通过不同接种量的比对，最终确定最佳接种量为麦麸(g)：菌液(mL)＝1：3.75。3、采用食用菌单口菌种袋作为发酵容器进行玫烟色棒束孢的固相发酵生产，结合真菌发酵特点，利用菌包进行发酵生产，既能提高通气量促进菌株生长，又能减少基质与外界接触的面积，减少污染。同时可以充分使用发酵室空间。该方法综合性好，系统性强等特点，可在玫烟色棒束孢的大规模生产中应用。具体实施方式以下将详细说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对玫烟色棒束孢WSWL21837菌株进行活化：采用萨氏培养基，于25±1℃、光照条件为16L:8D的培养箱中恒温培养15d；步骤二、制备一级液体菌种：采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，每5块菌饼置于100mL萨氏培养液中，然后置于25℃、光照条件为16L:8D、转速为200rpm/min的恒温摇床中培养3d，制得一级液体菌种，将每300mL菌液存放于容积为500mL的锥形瓶中；所述菌饼为利用直径为15mm的打孔器将经萨氏培养基活化后的菌落制成的直径为15mm，厚度为5mm的菌饼；步骤三、制备二级液体菌种：在摇床转速为100rpm/min条件下，采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，将制得的每5瓶一级液体菌种和200L萨氏培养液加入发酵罐中发酵，发酵温度环境在26‑28℃之间，罐压在0.02‑0.03Mpa之间；发酵的前16‑24h保持摇床转速为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min；整个发酵过程培养3d，制得二级液体菌种；步骤四、进行固体发酵培养：采用无菌麦麸作为培养基质，无菌食用菌单口菌种袋作为产孢容器，以无盖塑料框作为乘载容器，无菌食用菌单口菌种袋的长、宽、高分别为：350mm、105mm、200mm，无盖塑料框的长、宽、高分别为350mm、250mm、100mm，每个菌种袋装固相麦麸基质0.5kg，采用液‑固双相法，按照接种量固相麦麸基质：菌液＝1g：3.75mL的比例进行接种，之后平铺到塑料框中，放到培养架上进行培养，四周用经过灭菌处理的白色湿润棉布包围，保持相对湿度在90％以上、温度为25℃的密闭环境中培养3‑4d；待菌丝长满整个培养基质且表面出现孢子后，将固体培养基反扣于培养架上进行开放式培养，在相对湿度为85％、温度为27℃的环境中继续培养4‑5d，整个培养过程光照条件为L:D＝24:0；步骤五、对孢子粉进行干燥与收集：待固体培养基内、外部均布满玫烟色分生孢子后即停止产孢培养，将产孢盘置于30℃的温度环境中烘干处理72h，然后采用振荡筛收集孢子粉。...

【技术特征摘要】
1.一种玫烟色棒束孢WSWL21837菌株孢子粉生产方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对玫烟色棒束孢WSWL21837菌株进行活化：采用萨氏培养基，于25±1℃、光照条件为16L:8D的培养箱中恒温培养15d；步骤二、制备一级液体菌种：采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，每5块菌饼置于100mL萨氏培养液中，然后置于25℃、光照条件为16L:8D、转速为200rpm/min的恒温摇床中培养3d，制得一级液体菌种，将每300mL菌液存放于容积为500mL的锥形瓶中；所述菌饼为利用直径为15mm的打孔器将经萨氏培养基活化后的菌落制成的直径为15mm，厚度为5mm的菌饼；步骤三、制备二级液体菌种：在摇床转速为100rpm/min条件下，采用蛋白胨含量为2.5g/L、酵母粉含量为2.5g/L、葡萄糖含量为10.0g/L、pH为6.5的1/4萨氏培养液，将制得的每5瓶一级液体菌种和200L萨氏培养液加入发酵罐中发酵，发酵温度环境在26-28℃之间，罐压在0.02-0.03Mpa之间；发酵的前16-24h保持摇床转速为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min；整个发酵过程培养3d，制得二级液体菌种；步骤四、进行固体发酵培养：采用无菌麦麸作为培养基质，无菌食用菌单口菌种袋作为产孢容器，以无盖塑料框作为乘载容器，无菌食用菌单口菌种袋的长、宽、高分别为：350mm、105mm、2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思雨，陈斌，肖关丽，薛锐，郑亚强，桂富荣，和淑琪，严乃胜，李正跃，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53