一种胎盘造血干细胞制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘预处理；(2)胎盘一次灌洗；(3)胎盘二次灌洗；(4)胎盘三次灌洗；(5)混合离心；(6)胎盘初步纯化；(7)造血干细胞的冻存；该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘造血干细胞制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法。
技术介绍
造血干细胞(Hematopoieticstemcell,HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力，即可以通过一个细胞周期后产生两个与分裂前具有相同性质的细胞，以及具有在一定外界条件下分化成各类成熟血细胞的潜能。造血干细胞最先发生染色体易位等主要的致病突变，这种突变并不影响其分化能力，即可分化为具有正常功能的成熟血细胞，当已发生染色体易位的造血干细胞或者由发生了染色体易位的造血干细胞分化的成熟血细胞发生第二次突变，就会引发白血病，如急性髓细胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)和慢性髓细胞白血病(chronicmyelocyticleukemia，CML)的发生都与造血干细胞异常存在直接或间接的关系。造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也具有一定作用，如前列腺肿瘤细胞会模拟造血干细胞的分子信号，进入造血微环境，并引起造血干细胞表达谱的改变迫使造血干细胞离开，也可以通过表达造血细胞迁移相关的分子离开造血微环境，最终导致肿瘤的转移。随着对造血干细胞研究的深入，在临床治疗中，造血干细胞移植广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病等血液系统疾病，某些实体瘤以及自身免疫疾病等。通常，造血干细胞根据来源不同可分为三种，即骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞以及脐血造血干细胞。随着造血干细胞领域的研究进展，发现成熟的胎盘中存在大量的造血干细胞，相比于传统三种来源的造血干细胞，胎盘来源的造血干细胞不但免疫原性低、在数量上具备绝对优势，而且是相对更为原始的祖细胞，除此之外，胎盘为产妇生产后的废弃物，具有来源丰富，且采集过程不会对母体或新生儿造成损伤的优点。目前，现有的从胎盘提取造血干细胞的流程为：(1)将胎盘或胎盘小叶用机械法分解剪碎；(2)采用一种酶或多种酶联合分步骤消化；(3)取消化液用羟乙基淀粉法或淋巴细胞分离法分离出消化液中含有造血干细胞的单个核细胞；(4)分离出的单个核细胞用免疫磁珠法或流式细胞仪等方法富集。但是以上所述现有技术存在以下缺点：(1)分离过程长、操作步骤繁琐，容易丢失细胞的同时，极易造成细胞污染；(2)胎盘体积较大，消化过程需大量酶，且不易控制消化过程进度，容易造成过度消化，因细胞损伤而失活，并且酶的大量使用必然增加实验成本。另外，目前所用的造血干细胞冻存方法中所使用的冻存液添加了胎牛血清或供体自身的血清，血清含有大量未知成份，且质量不易控制，存在一定安全隐患，对后期临床应用造成一定困扰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种胎盘造血干细胞制备方法，该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案是：一种胎盘造血干细胞制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过多次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。作为一种改进的技术方案，步骤(1)中的胎盘清洗液为pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中每L磷酸盐缓冲液中含有100-500mg/L青霉素100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、100-500mg/L庆大霉素、50-200mg/L两性霉素B。作为一种改进的技术方案，步骤(2)中的胎盘灌洗液A为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液。作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的胎盘灌洗液B为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液、0.01-0.5wt％中性蛋白酶、0.01-0.5wt％Ⅰ型胶原酶。作为一种改进的技术方案，深低温冻存时步骤(7)中的冻存液含有体积分数为10％的DMSO和体积分数为90％、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液。作为一种改进的技术方案，非深低温冻存时步骤(7)中的冻存液中含有体积分数84％、质量浓度为30-50mgmg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液、体积分数为10％的DMSO和体积分数为6％、质量浓度为15-30g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：(1)造血干细胞在胎盘中含量丰富，主要分布在胎盘小叶和胎盘血中，本专利技术胎盘灌洗液B中含有中性蛋白酶和Ⅰ型胶原酶，这两种酶作用温和，不造成细胞损伤，这两种酶共同作可分离组织获得单个细胞，并且灌注过程中通过按压胎盘的操作，有助于灌洗液充分浸润胎盘小叶的毛细血管，有助于目的细胞从组织中游离出来，大大提高了目的细胞的分离率；(2)本专利技术实验操作简单，时间较短，不涉及胎盘组织剪碎及组织酶解消化，大大降低了实验操作过程中掺杂其他细胞，以及避免了实验过程复杂造成细胞污染的可能性；(3)本专利技术中的冻存液以勃脉力A溶剂替代了常用的不能用于临床的PBS，人血清白蛋白代替了不能用于临床的胎牛血清或不易获取的人血清血浆.采用上述冻存液将细胞进行冻存，有效提高了细胞复苏之后的复苏率。综上所述，采用本专利技术的制备方法大大提高了造血干细胞的分离率和细胞冻存复苏后的存活率，造血干细胞活性高，污染率低。附图说明图1为倒置显微镜下观察胎盘血来源的单个核细胞(40×)；图2为倒置显微镜下观察台盼蓝染色的胎盘血来源的单个核细胞(40×)；图3为倒置显微镜下造血干细胞集落形态(100×)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液(每1L，pH7.2的磷酸盐缓冲液中含有100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、100mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15‑30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过2‑5次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于‑80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。...

【技术特征摘要】
1.一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过2-5次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。2.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(1)中的胎盘清洗液为pH7.2-7...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，韩伟，邱青芳，姚立琼，潘德芹，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37