2G16葡糖淀粉酶组合物和方法技术

本发明专利技术涉及新的葡糖淀粉酶。

Composition and method of 2G16 Glucoamylase

The present invention relates to a new glucoamylase.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】2G16葡糖淀粉酶组合物和方法对相关申请的交叉引用本申请要求35U.S.C.§120下的优先权作为2016年8月5日提交的美国专利申请15/230,292的部分继续申请，其通过引用明确完整并入本文。序列表本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用完整并入本文。2016年12月5日创建的所述ASCII拷贝命名为5004_ST25.txt，并且大小为1,374千字节。专利
本专利技术涉及变体葡糖淀粉酶、编码变体葡糖淀粉酶的多核苷酸、生成变体葡糖淀粉酶的方法、以及使用该变体葡糖淀粉酶的方法。还描述了本专利技术的葡糖淀粉酶用于改变淀粉转化以产生发酵产物如乙醇和糖浆如葡萄糖以及动物原料的用途。本专利技术还涉及包含本专利技术的一种或多种变体葡糖淀粉酶的组合物。专利技术背景葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是一种催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由几种丝状真菌和酵母产生，曲霉属(Aspergillus)的那些通常对商业目的最重要。商业上使用葡糖淀粉酶将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉的材料转化为葡萄糖。然后，可以使用发酵生物体将葡萄糖直接或间接转化为发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素和其他难以合成产生的化合物。发酵方法也常用于可饮用的酒精(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在生产酸奶和奶酪中)业中。最终产物也可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但也可以例如通过葡萄糖异构酶转化为果糖或几乎同等地由葡萄糖和果糖组成的混合物。此种混合物或进一步富含果糖的混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。最终产物也可以是饲喂农业动物的商业原料。此外，葡糖淀粉酶在食品、纺织和制药业中具有重要应用。例如，在食品业中，葡糖淀粉酶用于改善面包皮的颜色并产生低卡路里啤酒。当与其他酶的混合物一起使用时，葡糖淀粉酶的另一个关键应用是作为消化助剂。然而，本领域仍需要具有增加的活性、热活性、热稳定性和pH稳定性的变体葡糖淀粉酶。本专利技术满足了此种需要，并提供了与亲本葡糖淀粉酶相比具有改善性质的变体葡糖淀粉酶。本专利技术的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的变体葡糖淀粉酶和编码变体葡糖淀粉酶的多核苷酸以及在各种方法中使用变体葡糖淀粉酶的方法。专利技术概述因此，本专利技术提供了分离的野生型葡糖淀粉酶以及变体葡糖淀粉酶和其使用方法。在一方面，本专利技术提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列，例如外源启动子和/或选择基因可操作地连接的编码SEQIDNO:1的核酸。在另一方面，包含编码SEQIDNO:1的核酸的核酸构建体是染色体外表达载体，并且可以包含复制起点和/或选择基因。在又一方面，核酸构建体是整合表达载体。在另外的方面，本专利技术提供了宿主细胞，其包含编码SEQIDNO:1的核酸，其中所述宿主细胞不是Thielaviopsispunctuala细胞。宿主细胞还可以包含与编码SEQIDNO:1的核酸可操作地连接的外源启动子和选择基因。在又一方面，本专利技术提供了生成宿主细胞的方法，包括用核酸构建体转化细胞，使得宿主细胞表达SEQIDNO:1。核酸构建体可以是染色体外表达载体，从而产生葡糖淀粉酶，其可以任选地从细胞培养基中回收。在另外的方面，本专利技术提供了从淀粉底物的碳水化合物糖化的方法，包括使底物与SEQIDNO:1的葡糖淀粉酶接触，其中降解淀粉。在另外的方面，本专利技术提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代在选自下组的位置编号处：14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588。在此方面的一些实施方案中，变体酶与SEQIDNO:1,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:207,SEQIDNO:307和SEQIDNO:361中的一种或多种是至少95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与SEQIDNO:1不是100％相同的。在另外的方面，本专利技术提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代在选自下组的位置编号处：14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588，其中变体葡糖淀粉酶在选自下组的条件下与SEQIDNO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于40℃的活性和热活性、于57℃的热稳定性、于59℃的热稳定性、于62℃的热稳定性、于67℃的热稳定性和于72℃的热稳定性。在此方面的一些实施方案中，变体酶与SEQIDNO:1,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:207,SEQIDNO:307和SEQIDNO:361中的一种或多种是至少95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与SEQIDNO:1不是100％相同的。在又一方面，本专利技术提供了变体葡糖淀粉酶，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代选自下组：S14Q,K23N,K23R,K23Y,S30D,S30N,S30P,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A111G,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A31本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ IDNO:1相比的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：111、30、14、23、31、35、36、39、44、49、50、51、53、69、83、98、117、118、119、121、147、157、179、186、197、250、262、284、286、287、288、300、309、311、317、347、362、385、388、400、413、415、419、423、434、457、463、516、526、530、533、534、535、540、545、547、553、555、564、572、576、577、581、583、585和588，且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少95％相同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.05 US 15/230,2921.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO:1相比的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：111、30、14、23、31、35、36、39、44、49、50、51、53、69、83、98、117、118、119、121、147、157、179、186、197、250、262、284、286、287、288、300、309、311、317、347、362、385、388、400、413、415、419、423、434、457、463、516、526、530、533、534、535、540、545、547、553、555、564、572、576、577、581、583、585和588，且其中所述变体酶与SEQIDNO:1至少95％相同。2.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：A111G,S14Q、K23N、K23R、K23Y、S30D、S30N、S30P、T31E、T31K、T31N、T31Q、A35L、S36R、S39A、L44I、T49K、T49R、S50E、S50I、S50N、S50Y、N51D、D53N、I69L、I69M、E83K、T98S、A117P、A117V、D118N、L119M、Q121A、Q121P、Y147W、C157W、Y179F、P186Y、Y197H、S250D、S250E、S250K、A262S、Q284H、I286A、T287N、T288H、A300L、A300Q、T309D、T309E、T309Q、L311V、A317K、L347K、T362A、S385L、S385Q、T388I、T388K、T388Y、T400K、N413S、A415D、A415F、A415N、A415S、A415T、A415W、A415Y、Q419P、Q423M、Q423P、S434T、G457N、G457P、T463F、F516L、L526F、S530E、S530G、T533K、A534L、S535E、S535G、S535K、S535T、T540A、T540S、V545L、Q547A、Q547H、F553Y、F555Y、I564F、K572E、V576I、V576L、G577R、T581I、T581K、V583F、V585P和S588Q。3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自下组的条件下与SEQIDNO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于40℃的活性和热活性、于57℃的热稳定性、于59℃的热稳定性、于62℃的热稳定性、于67℃的热稳定性和于72℃的热稳定性。4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含取代A111G。5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含取代S30P/A111G。6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P。7.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P。8.根据权利要求1-5或7中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/A415Y/N413S/Q423P。9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQIDNO:1的亲本葡糖淀粉酶表现出至少95％、97％、98％、或99％同一性。10.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:3。11.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:5。12.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:207。13.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:307。14.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:361。15.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自下组的氨基酸取代：A111G/Q547A、A111G、A111G/Y179F、I69M/A111G/Q547H、I69L/A111G、A111G/Q419P、A111G/F555Y、I69L/A111G/Q547A、A111G/L311V、A111G/I286A/T288H/L311V/F516L/Q547A、Q547A、A111G/F516L/F555Y、A111G/A262S/Q547A、A111G/Y179F/A262S、A111G/Y147W、A117V/I564V、T98S/A117V/I564V、A117V、A117V/Q284H/T287N/I564V、I564V、T98S/A117V、V545L、A117V/F553Y、A117V/S434T、A117V/Y197H/V545L、T98S/A117V/F553Y、S30N/A111G、T49R/A111G、L44I/A111G、A111G/A117P、S30P/A111G、K23N/A111G、T31N/A111G、T31E/A111G、D53N/A111G、N51D/A111G、S39A/A111G、K23R/A111G、A35L/A111G、T31Q/A111G、T31K/A111G、S50I/A111G、S50Y/A111G、T49K/A111G、K23Y/A111G、S50E/A111G、S36R/A111G、S30D/A111G、A111G/S530E、A111G/T540S、A111G/S535E、A111G/S530G、A111G/T533K、A111G/A534L、A111G/S535T、A111G/Q423P、A111G/Q423M、A111G/Q121A、A111G/S535G、A111G/T540A、A111G/L119M、A111G/Q121P、A111G/S535K、A111G/V585P、A111G/V583F、A111G/G577R、A111G/T581K、A111G/V576I、A111G/K572E、A111G/V576L、A111G/S588Q、A111G/T581I、S30P/A111G/N413S、S30P/A111G/N413D、S30P/A111G/T362A、S30P/A111G/G457P、S30P/A111G/T463F、S30P/A111G/A317K、S30P/A111G/T388K、S30P/A111G/T388I、S30P/A111G/T388Y、S30P/A111G/G457N、S30P/A111G/P186Y、S30P/A111G/K23R/S39A/N51D、S30P/A111G/K23R/S39A/S50E/L119M/Q121P、S30P/A111G/K23R/T49K/S50E、S30P/A111G/K23R/S50E/N51D/A117V/L119M、S30P/A111G/L119M/Q121A、S30P/A111G/S39A/S50I/N51D/Q423P、S30P/A111G/Q423P、S30P/A111G/K23R/Q423P、S30P/A111G/A117P、S30P/A111G/S39A/A117V、S30P/A111G/S39A/T49R/L119M、S30P/A111G/T49K/Q423P、S30P/A111G/N51D/L119M、S30P/A111G/A117V/L119M/Q121P/Q423P、S30P/A111G/T49R/A117P/L119M、S30P/A111G/L119M、S30P/A111G/S39A/T49R/S50I/N51D、S30P/A111G/A117V、S30P/A111G/S39A、S30P/A111G/K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P、S30P/A111G/K23R/T49R、S30P/A111G/K23R/N51D/L119M/Q121P、S30P/A111G/L44I/A117V/L119M、S30P/A111G/T31K/L119M/Q423P、S30P/A111G/L44I、S30P/A111G/A415N、S30P/A111G/T400K、S30P/A111G/A415D、S30P/A111G/A415Y、S30P/A111G/L347K、S30P/A111G/A415T、S30P/A111G/A415W、S30P/A111G/A415F、S30P/A111G/T309Q、S30P/A111G/S385L、S30P/A111G/S385Q、S30P/A111G/S250E、S30P/A111G/T309E、S30P/A111G/T309D、S30P/A111G/S14Q、S30P/A111G/S250D、S30P/A111G/S250K、S30P/A111G/A300Q、S30P/A111G/A300L,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/N51D/Q121P、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/A117V、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/Q121P/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D/N413S、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/A117V/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/L44I/N51D/A117V、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/S50N/N51D/C157W、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/A117V、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V/Q121A、K23R/S39A/T49R/...

【专利技术属性】
技术研发人员：X张，J杨，G巴纳吉，K吴，Y张，
申请(专利权)人：福尼亚生物处理股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US