一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物、基因工程领域，涉及一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌种及其构建方法与应用。本发明专利技术建立了一种产葡糖淀粉酶乳酸生产菌株的构建方法，并结合该重组菌产葡糖淀粉酶的属性和乳酸单体的合成特征以淀粉液化液为原料建立了发酵生产聚合级D‑乳酸和聚合级L‑乳酸的新工艺，形成了直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的技术，可以实现10m

【技术实现步骤摘要】
一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用
：本专利技术构建了一种产葡糖淀粉酶乳酸生产菌株，并结合该重组菌产葡糖淀粉酶的属性和乳酸单体的合成特征以淀粉液化液为原料建立了发酵生产聚合级D-乳酸和聚合级L-乳酸的新工艺，属于微生物、基因工程

技术介绍
：乳酸生产菌种经历了四代发展过程：第一代乳酸生产菌种以米根霉为代表，主要用于生产L-乳酸，产酸水平约为10％～11％，发酵周期较长(约70h)，且发酵过程L-乳酸光学纯度不稳定，介于55％～95％之间；第二代乳酸生产菌种以国内自主选育的乳酸细菌为主，发酵周期缩短至50h，但产酸水平仅为9％～10％，尽管该类生产菌种具备同时合成L-乳酸和D-乳酸的能力，合理控制仍可发酵生产L-乳酸占总乳酸95％以上的乳酸产品；第三代乳酸生产菌种也是目前在乳酸生产企业中普遍使用的乳酸生产菌种以国外进口的嗜热乳杆菌为主，同样约50h的发酵周期，产酸水平已大幅度调高至16％以上；然而上述三代乳酸生产菌种存在一个共同的问题，即发酵过程中二元羧酸的伴生问题始终未解决。二元羧酸存在的最大影响是现有乳酸产品作为单体用于聚乳酸的加工聚合过程中，二元杂酸改变了聚乳酸分子链条聚合方向的一致性而导致聚合过程终止，因此无法制备高分子量或高品质的聚乳酸材料。这一现状导致了聚乳酸材料加工产业长期面临无米下锅的窘境。更为尴尬的乳酸制造业同时面临食品级乳酸制造产业产能严重过剩的现状。第四代乳酸生产菌种，也称乳酸单体生产菌种，从遗传背景的修饰出发，根本上解决了二元杂酸存在的问题，并形成了高品质聚合级乳酸单体的产业化制造能力，其主要生产菌种以重组大肠杆菌和重组酵母为代表。经代谢途径改造后的重组菌可以在工业化规模下制备高光学纯度L-乳酸和D-乳酸(Niuetal.MicrobialCellFactories2014,13:78；ZL201210102731.8)，其光学纯度大于99.9％，化学纯度大于98.4％。上述重组菌可使用结晶葡萄糖或高浓度的葡萄糖糖化液进行高纯度L-乳酸和D-乳酸的发酵生产(ZL201210102731.8)。借鉴食品级乳酸生产体系(嗜热乳杆菌为主)已成功实现以淀粉液化液预糖化的方式同步糖化同步生产乳酸(ZL201410063333.9)，且体现出显著的降低生产成本的特性。本专利技术以高产聚合级L-乳酸和聚合级D-乳酸的重组菌为出发菌株，采用基因工程技术，建立了一种新型葡糖淀粉酶的筛选方法和具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌株的构建方法，并形成了直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的技术。
技术实现思路
：本专利技术以微生物或植物来源的葡糖淀粉酶基因核酸序列为依据，参考聚合级乳酸单体高产菌株的密码子偏好性进行密码子优化，然后再通过引入强启动子和高效率信号肽等元件，借助重构的表达质粒增加葡糖淀粉酶基因拷贝数，以聚合级乳酸单体高产菌株为出发菌株，获得了高效表达葡糖淀粉酶的聚合级乳酸单体高产菌株，建立了10-300m3发酵体系下直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的新工艺；进一步地，上述葡糖淀粉酶基因来源于产酶丰富的微生物，如烟曲霉，黑曲霉，亮白曲霉，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽胞杆菌，谷氨酸棒杆菌，凝结芽胞杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母等；更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因的获得方式既可以是以来源于微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，还可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成；优选地，所述葡糖淀粉酶基因为glaFs71，其核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，其编码的葡糖淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.21所示；所述glaFs71基因编码的葡糖淀粉酶发酵液酶活为3000-4200U/mL，最适作用温度为40℃，最适作用pH为6.5，且在pH5.0-7.0以及20℃-50℃下均有较好的稳定性；更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因克隆表达的目标宿主菌为可高效合成聚合级D-乳酸单体或聚合级L-乳酸单体的菌株，且该目标菌株可以根据需要进行遗传修饰，目标宿主菌可以是米根霉，酿酒酵母，毕赤酵母，地衣芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，凝结芽胞杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等；优选地，所述宿主菌为聚合级D-乳酸单体高产菌株CGMCCNo.11059；优选地，所述宿主菌为聚合级L-乳酸单体高产菌株CGMCCNo.11060；更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因可以在目标宿主菌中引入的启动子序列下游进行高效转录，高效启动子可以是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶等相关基因的操纵子，也可以是闭环质粒自带的诱导型启动子；更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因可以在目标宿主菌优势基因的信号肽序列下游进行高效表达，优势基因的信号肽可以是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶等相关基因的操纵子，也可以是闭环质粒自带的信号肽序列；表达方式可以是分泌表达，也可以是周质空间高效表达；优选地，所述启动子为PR-PL启动子，所述信号肽为pelBs。更进一步地，用于上述葡糖淀粉酶基因高效表达的质粒载体可以是1-4个拷贝的质粒，也可以是400个拷贝左右的质粒，还可以是温度诱导调控型质粒整体。更重要的是该质粒载体同时携带了在目标宿主菌和模式大肠杆菌中高效复制需要的复制子，便于质粒在目标宿主菌中的高拷贝复制；优选地，葡糖淀粉酶基因高效表达的质粒载体为pMD9-T；更进一步地，获得的产葡糖淀粉酶重组菌可以高效利用葡萄糖合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，还可以直接利用淀粉液化液或经适度糖化后的糖化液合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，方法如下：菌种在10-300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验，2-5％接种量下，在25-36℃进行好氧培养，至OD600值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：第0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；第3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；第6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，第10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；第16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；残糖低于1g/L时发酵结束。其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵11-25，磷酸二氢钾3-5，磷酸氢二钠15-25，氯化钠2-5，MgSO40.2-0.5，FeSO40.3-1，FeCl30.2-1，CoCl20.3-1，CuCl20.4-1，Na2MoO40.2-1，H3BO30.1-1，MnCl20.2-1，柠檬酸10-25，硫胺素0.2-1，木糖5-50，甘油5-50，葡萄糖5-50，硫酸1-5，其余为水，pH6.0-7.5。本专利技术形成的发酵工艺可以有效消除葡萄糖对细胞生长及产物合成的不利影响，最大限度实现细胞的高活性和产物合成效率的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.21所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.21所示。2.权利要求1所述的一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述葡糖淀粉酶的编码基因为glaFs71，其核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。3.权利要求1或2所述葡糖淀粉酶的应用。4.含有权利要求1所述葡糖淀粉酶的重组菌株。5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主菌为聚合级D-乳酸单体高产菌株CGMCCNo.11059或聚合级L-乳酸单体高产菌株CGMCCNo.11060。6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，葡糖淀粉酶表达的质粒载体为pMD9-T，启动子为PR-PL启动子，信号肽为pelBs。7.权利要求4-6任意一项所述重组菌株的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌株直接利用淀粉液化液或经适度糖化后的糖化液合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，方法如下：菌种在10-300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验，2-5％接种量下，在25-36℃进行好氧培养，至OD600值为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0...

【专利技术属性】
技术研发人员：田康明，牛丹丹，王正祥，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12