葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及葡糖淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Glucoamylase variants and polynucleotides encoding them

The present invention relates to glucoamylase variants. The present invention also relates to polynucleotides encoding these variants, nucleic acid constructs comprising these polynucleotides, vectors and host cells, and methods of using these variants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸对序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。还描述了本专利技术的葡糖淀粉酶用于淀粉转化以产生发酵产物，例如乙醇、和糖浆(例如葡萄糖)的用途。本专利技术还涉及一种包括本专利技术的葡糖淀粉酶的组合物。相关技术描述葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉菌属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。最终产物还可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。本专利技术的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程(例如乙醇生产过程)中提供高产量。WO2011/068803披露了从真菌粘褶菌，特别是从篱边粘褶菌和密粘褶菌分离的葡糖淀粉酶。WO2014/177546披露了WO2011/068803中披露的亲本葡糖淀粉酶的变体。本专利技术提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。专利技术概述本专利技术涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。本专利技术也涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。在一个另外的方面，本专利技术涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置271、或295、或271和295的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。本专利技术另外涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及生产这些变体的方法。在另一方面，本专利技术涉及由含淀粉材料生产发酵产物(具体是乙醇)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)使液化的材料糖化；和(c)用发酵生物进行发酵；其中使用葡糖淀粉酶变体的至少一种变体进行步骤(b)。在另一方面，本专利技术涉及由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)在本专利技术的变体葡糖淀粉酶的存在下，使液化的材料糖化；在再另一个方面，本专利技术涉及包括本专利技术的变体的组合物。在另一方面，本专利技术涉及该变体葡糖淀粉酶用于生产糖浆或发酵产物的用途。附图简述图1示出了作为通过HPLC分析的酶活性(AGU/gDS)的函数的乙醇产量。将选择的变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶JGA098和来自瓣环栓菌(Tc-AMG)、篱边粘褶菌(Gs-AMG)、血红密孔菌(Ps-AMG)的野生型葡糖淀粉酶进行比较。定义葡糖淀粉酶：术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本专利技术的目的，根据实例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。在另一实施例中，本专利技术的多肽具有SEQIDNO:2的多肽的至少20％、优选至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然发生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指为编码本专利技术的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环状D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.23 EP 14190070.41.一种葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。2.如权利要求1所述的变体，进一步包括至少在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置32、83、163、169、219、224、303或410的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。4.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：295F、295W、224A、224I、224T、32V、83D、163A、163W、169I、219R、303N或410K。5.如上述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个：295W；295W+410K；224I+295F；224T+295W+318V；295F；224A+295F；295W+83D+410K；163A+295W+410K；163W+295W+410K；303N+295W；169I+295W；或32V+219R+295W；其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。6.根据权利要求1-5中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个：295W+410K；或163A+295W+410K；其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。7.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中这些取代选自以下各项：Y295F、Y295W、L224A、L224I、L224T、A32V、S83D、N163A、N163W、V169I、T219R、S303NR410K、和Q318V。8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中这一改进的特性是降低的葡萄糖抑制。9.一种葡糖淀粉酶变体，包括在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。10.如权利要求8所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。11.如权利要求9所述的变体，其中该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：72V、77A、145A、219D、271Q、271N、271A、271S、271V、224Q、303E、318W、318F、410A、410Q或410H。12.根据权利要求9-11所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个：72V+145A；271Q；224Q+271N+410A；77A；77A+271A；271S+318W+410Q；271V+318F+410H；77A+219D；77A+303E；其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。13.根据权利要求9-12所述的变体，其中这些取代选自以下各项：D72V、L77A、L145A、T21...

【专利技术属性】
技术研发人员：福山志朗，堤纪子，绫部圭，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK