葡糖淀粉酶的变体制造技术

本发明专利技术涉及葡糖淀粉酶的变体，具体地亲本葡糖淀粉酶具有改变的特性的组合变体，所述变体用于减少淀粉水解过程中缩合产物的合成。因此，所述亲本葡糖淀粉酶变体适合例如在酿造和葡萄糖浆生产中使用。本发明专利技术还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中产生所述葡糖淀粉酶变体的方法。

Glucose amylase variants

The present invention relates to a variant of glucoamylase, in particular a combination variant of a parent glucoamylase with altered characteristics, which is used to reduce the synthesis of condensation products during starch hydrolysis. Therefore, the parent glucoamylase variant is suitable for use in brewing and glucose syrup production, for example. The invention also discloses a DNA construct encoding the variant and a method for producing the glucose amylase variant in the host cell.

【技术实现步骤摘要】
葡糖淀粉酶的变体本申请是申请日为2011年6月30日的中国专利申请201180032785.5“葡糖淀粉酶的变体”的分案申请。
本专利技术公开了亲本葡糖淀粉酶的组合变体，所述组合变体具有改变的特性并且适合例如在酿造和葡萄糖浆生产中使用。本专利技术还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中产生所述葡糖淀粉酶变体的方法。
技术介绍
葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶，EC3.2.1.3)是淀粉水解外切作用糖酶，其可催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单位。葡糖淀粉酶可水解淀粉(如直链淀粉和支链淀粉)的直链的和分支的糖苷键。葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌、酵母和植物的株系产生。特别引人关注的且在商业上重要的葡糖淀粉酶是例如从曲霉菌属(Aspergillus)(Svensson等人，CarlsbergRes.Commun.(《嘉士伯研究通讯》)48：529-544(1983)；Boel等人，EMBOJ.(《欧洲分子生物学学会杂志》)3：1097-1102(1984)；Hayashida等人，Agric.Biol.Chem.(《农业和生物化学》)53：923-929(1989)；美国专利No.5,024,941；美国专利No.4,794,175和WO88/09795)；篮状菌属(Talaromyces)(美国专利No.4,247,637；美国专利No.6,255,084；和美国专利No.6,620,924)；根霉菌属(Rhizopus)(Ashikari等人，Agric.Biol.Chem.(《农业和生物化学》)50：957-964(1986)；Ashikari等人，App.Microbio.Biotech.(《应用微生物学和生物技术》)32：129-133(1989)和美国专利No.4,863,864)；腐质霉属(Humicola)(WO05/052148和美国专利No.4,618,579)；和毛霉属(Mucor)(Houghton-Larsen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》)62：210-217(2003))的菌株胞外产生的真菌酶。已经在酵母、真菌和/或细菌细胞中克隆和表达了许多编码这些酶的基因。在商业上，葡糖淀粉酶是十分重要的酶并已用于需要对淀粉进行水解(例如，用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的广泛的各种应用。葡糖淀粉酶用于生产高果糖玉米甜味剂，高果糖玉米甜味剂占据超过美国50％的甜味剂市场。通常，在淀粉水解工艺中葡糖淀粉酶可与且通常与α-淀粉酶一起使用，以将淀粉水解为糊精，然后水解为葡萄糖。然后可将葡萄糖由其他酶(如葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以产生多种终产物(如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸盐、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油和1，3-丙二醇)。通过在含淀粉和/或纤维素的材料的发酵中使用葡糖淀粉酶而产生的乙醇可用作燃料来源或用于酒精消费。在商业上用于高葡萄糖玉米糖浆(HGCS)和高果糖玉米糖浆(HFCS)生产的高固形物浓度下，葡糖淀粉酶通过缩合反应合成二糖、三糖和四糖。这是由于淀粉中α-(1-6)-D-葡萄糖苷键的水解缓慢以及由D-葡萄糖形成多种积聚的缩合产物(主要是异麦芽糖)而引起的。因此，许多常规工艺中葡萄糖的产率不超过理论产率的95％，全世界通过该工艺生产的糖浆量是非常大的，即使每吨淀粉的葡萄糖产率有十分小的增加在商业上都是重要的。葡糖淀粉酶在酿造中主要用于生产低碳啤酒。与其他淀粉酶(如来自麦芽的淀粉酶)结合，葡糖淀粉酶提供对淀粉非常充分的水解，直至水解为葡萄糖单元。葡萄糖很容易由酵母转化为醇，从而使得啤酒厂有可能由发酵获得十分高的醇产率并且同时获得啤酒，这在残留的碳水化合物方面是十分低的。用水将发酵物稀释至所需的醇百分比，将最终的啤酒作为“低碳啤酒”销售。尽管葡糖淀粉酶已成功用于商业应用许多年，但仍需要具有改变的特性(如比活性改善、缩合产物如异麦芽糖的形成减少以及热稳定性增加)的葡糖淀粉酶。本申请中对任何文献的引用或确定并非承认所述文献可作为本专利技术的现有技术。
技术实现思路
本文考虑了葡糖淀粉酶变体以及葡糖淀粉酶变体在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途。这些葡糖淀粉酶变体在催化结构域和/或淀粉结合结构域中含有氨基酸置换。所述变体显示出改变的特性，如比活性改变、缩合产物如异麦芽糖的形成减少和/或热稳定性改变。在一个方面，本文描述了包含如下氨基酸置换的葡糖淀粉酶变体：a)44R和539R；或b)44R、61I和539R，所述位置对应于SEQIDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQIDNO：1或2或亲本葡糖淀粉酶具有至少80％的序列同一性。在一另外的方面，描述了葡萄糖淀粉酶用于制备酶组合物的用途。在一另外的方面，所述酶组合物包含至少一种额外的酶，所述额外的酶选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶和另外的葡糖淀粉酶例如支链淀粉酶和α-淀粉酶。在一另外的方面，本文描述了具有淀粉结合结构域和催化结构域的葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，相对于SEQIDNO：2的氨基酸序列或等价的亲本葡糖淀粉酶，所述变体在互联环2′中，和/或在环1中，和/或在螺旋2中，和/或在环11中，和/或在螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于具有SEQIDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQIDNO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQIDNO：2位置52至位置68的氨基酸序列的螺旋2或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQIDNO：2位置396至位置420的氨基酸序列的环11或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或具有SEQIDNO：2位置421至位置434的氨基酸序列的螺旋12或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。在一另外的方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体用于在淀粉水解期间减少缩合产物的合成的用途，所述葡糖淀粉酶变体相对于SEQIDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQIDNO：2位置21至位置51的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQIDNO：2位置52至位置68的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQIDNO：2位置396至位置420的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列和/或SEQIDNO：2位置421至位置434的氨基酸序列或亲本葡糖淀粉酶中的等价残基序列，包含两个或更多个氨基酸置换。在一另外的方面，描述了葡糖淀粉酶变体的用途，其中所述两个或更多个氨基酸置换是相对于具有SEQIDNO：2位置518至位置543的氨基酸序列的互联环2′，和/或具有SEQIDNO：2位置21至位置51的氨基酸序列的环1，和/或具有SEQIDNO：2位置52至位置68本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在亲本葡糖淀粉酶的基础上被如下置换：a.44R和539R；或b.44R、61I和539R，所述位置44、61和539对应于SEQ ID NO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述亲本葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8或9。

【技术特征摘要】
2010.07.15 DK PA201070337;2010.08.18 EP PCT/EP20101.一种葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在亲本葡糖淀粉酶的基础上被如下置换：a.44R和539R；或b.44R、61I和539R，所述位置44、61和539对应于SEQIDNO：2中的各位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置，其中所述亲本葡糖淀粉酶包含SEQIDNO：1、2、3、5、6、7、8或9。2.权利要求1的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶包含SEQIDNO：1或2。3.权利要求2的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶由SEQIDNO：1或2组成。4.根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体具有与SEQIDNO：1、2、11、385、386、387、388、389或390的淀粉结合结构域具有100％序列同一性的淀粉结合结构域。5.根据权利要求1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·E·德格恩，R·R·博特，C·W·夫罗门，M·S·舍弗斯，W·阿勒，E·彼得森，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK