一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分及制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分的制备及其应用。本发明专利技术以鹿茸为原料，建立了具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分制备方法，该活性组分可应用于阿尔兹海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。

An Active Component of Antler with Prolyl Endonuclease Inhibitory Activity and Its Preparation and Application

The invention relates to the preparation and application of an active component of velvet antler with prolyl endonuclease inhibitory activity. The preparation method of the active component of pilose antler with prolyl endonuclease inhibitory activity is established by using pilose antler as raw material. The active component can be applied to the prevention and treatment of cognitive impairment diseases such as Alzheimer's disease, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分及制备和应用
本专利技术涉及一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分的制备及其应用，所述具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分，可用于治疗或预防神经性退化性疾病如阿尔兹海默症、帕金森症等认知障碍疾病。
技术介绍
鹿茸是鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿密生绒毛的未骨化的幼角，始载于汉代的《神农本草经》，入药已有2000多年的历史，其后在历代本草中对鹿茸的药用均有收载。《本草纲目》记载鹿茸能够“生精补髓、养血益阳、强筋健骨，治一切虚损、耳聋、目暗、眩晕虚痢”(文献1：吉静娴,钱璟,黄凤杰,等.鹿茸的活性物质及药理作用的研究进展.ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics,2009,30(2):141-143)。脯氨酰内切酶(ProlylEndopeptidase，PEP)，也被称为脯氨酰寡肽酶，是一种高保留的丝氨酸蛋白酶。PEP在含脯氨酸神经肽的新陈代谢中扮演重要角色，PEP的活动与诱导神经退行性疾病(如阿尔兹海默症和帕金森症等)的产生有关。研究表明PEP抑制剂可能会因阻断PEP的新陈代谢而达到改善记忆力的目的。因此，PEP抑制剂可以作为一种潜在的修复阿尔兹海默症患者记忆力的药物进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有PEP抑制活性的鹿茸水提物及其应用。鹿茸水提物经过胃蛋白酶和胰酶作用后的酶解产物具有PEP抑制活性，可作为改善阿尔兹海默症等认知障碍疾病药物研发的潜在来源。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：(1)新鲜鹿茸切碎，加入鹿茸质量5～30倍的去离子水，升温至90～100℃(最优范围为95～100℃)，搅拌提取1～5(最优范围为2～4)小时，提取结束后降至室温，用170～270(最优范围为200～230)目的滤网过滤，滤液即为提取物。(2)用1～6M的HCl将提取物的pH调至1.0～5.0(最优范围为1.5～2.0)，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶A，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)；酶解结束后用1～6M的NaOH将pH调节至6.0～8.0(最优范围为6.5～7.5)，再加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶B，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)，反应结束后将温度升至90～100℃(最优范围为95～100℃)并保温10～30分钟后降至室温。(3)上述酶解液以15000×g～25000×g的速度于4～8℃离心20～30分钟，收集上清液，用截留分子量为5K～20K道尔顿的超滤膜于10000×g～16000×g的速度超滤20～30分钟，收集滤液冷冻干燥，获得具有脯氨酰内切酶抑制活性的组分。所述蛋白水解酶A为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或几种组合；蛋白水解酶B为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种组合。蛋白水解酶A和蛋白酶B不能相同。所制备的活性组分含有LPQPPQE、GPAGPQGPR、LPPLTAD、PPGLPGSPGQ等脯氨酰内切酶抑制肽。所述具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分，可用于治疗或预防神经性退化性疾病如阿尔兹海默症、帕金森症等认知障碍疾病。本专利技术建立了一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分的制备方法，所制备的鹿茸PEP抑制肽可应用于阿尔兹海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1.使用本方法所制备的鹿茸活性组分提取率高、反应条件温和，对鹿茸中原有的活性组分保留较好，方法简便可行，可大规模生产。2.结合前沿分析技术LC-MS/MS技术对鹿茸活性组分物质基础进行剖析，使结果更加准确可信。3.具有良好的应用前景。本专利技术作为认知障碍疾病药物研发的潜在来源具有广泛的应用前景。具体实施方式实施例1以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入5L去离子水，升温至100℃，搅拌提取5小时，提取结束后降至室温，用200目的滤网过滤，滤液即为鹿茸提取物。用6M的HCl将提取物的pH调至2.0，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在37℃温度下酶解5小时；酶解结束后用1M的NaOH将pH调节至7.0，再加入1g胰蛋白酶，在37℃温度下酶解5小时，反应结束后将温度升至100℃并保温10～30分钟后降至室温。上述酶解液以15000×g的速度于4℃离心30分钟，收集上清液，用截留分子量为10K道尔顿的超滤膜于10000×g的速度超滤30分钟，收集滤液冷冻干燥，获得具有PEP抑制活性的组分。对获得的鹿茸组分进行PEP抑制活性检测1.原理PEP能够特异性地在脯氨酸的羧基末端水解小分子量多肽因此本方法采用Z-Gly-Pro-4-nitroanilide作为PEP的底物，Z-Gly-Pro-4-nitroanilide被PEP切下Z-Gly-Pro后，生成黄色的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，根据加入样品和底物前后的405nm下的吸光度变化，可以计算样品对于PEP的抑制活性。2.方法(1)样品：将样品溶解于10mM的PBS缓冲液(pH＝7.0)，按实验需要分别配制成0.5、1.0和2.0mg/mL浓度的溶液。(2)底物溶液：Z-Gly-Pro-4-nitroanilide(Z-Gly-Pro-pNA)溶液，Z-Gly-Pro-4-nitroanilide用40％(v/v)的二氧六环配制成10mM的溶液。(3)阳性药物：丙戊酸钠(SodiumValproate)溶液，丙戊酸钠溶于10mM的PBS(pH＝7.0)，按实验需要将其分别配制成0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mM浓度的溶液。(4)酶溶液：PEP溶液，将PEP用保护液(45mMTris-HCl，pH8.0，124mMNaCl，2.4mMKCl，10％(v/v)甘油，225mM咪唑和3mMDTT)稀释成1U/mL的溶液分装储存于-80℃冰箱，临用前用PBS(10mMPBS，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.0)稀释8倍，作为PEP溶液。实验在96孔板中进行，利用酶标仪在405nm检测吸光度。首先将140μLPBS，20μL样品(或缓冲液)和20μLPEP酶溶液依次加入到样品孔中，37℃孵育5min后，再加入20μL底物，混匀后于37℃温育30分钟，用酶标仪测定405nm吸光度。反应总体积为200μl。每孔做三个平行，计算样品抑制率。表1PEP抑制活性实验分组及加样量注：“-”表示不加任何试剂。抑制率计算公式：其中I表示抑制率，ASample表示样品吸光度值，ASampleblank表示样品空白吸光度值，AControl表示阴性对照组吸光度值，Ablank表示空白组吸光度值。3阳性对照检测结果按上述方法分别检测阳性对照物丙戊酸钠浓度为0.2、0.4、1、2和4mM浓度时，阳性对照物丙戊酸钠的PEP抑制活性。结果如表2所示：表2阳性对照样品浓度及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分的制备方法，其特征在于：将鹿茸提取、酶解、纯化，得到具有抑制脯氨酰内切酶活性的鹿茸活性组分；具体过程如下：1)新鲜鹿茸切碎，加入鹿茸质量5～30倍(最优范围为10～20倍)的去离子水，升温至90～100℃(最优范围为95～100℃)，搅拌提取1～5小时(最优范围为2～4)，提取结束后降至室温，用170～270(最优范围为200～230)目的滤网过滤，滤液即为提取物；2)用1～6M的HCl将提取物的pH调至1.0～5.0(最优范围为1.5～2.0)，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶A，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)；酶解结束后用1～6M的NaOH将pH调节至6.0～8.0(最优范围为6.5～7.5)，再加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶B，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)，反应结束后将温度升至90～100℃(最优范围为95～100℃)并保温10～30分钟后降至室温；3)上述酶解液以15000×g～25000×g的速度于4～8℃离心20～30分钟，收集上清液，用截留分子量为5K～20K道尔顿的超滤膜于10000×g～16000×g的速度超滤20～30分钟，收集滤液冷冻干燥，获得具有脯氨酰内切酶抑制活性的组分。...

【技术特征摘要】
1.一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分的制备方法，其特征在于：将鹿茸提取、酶解、纯化，得到具有抑制脯氨酰内切酶活性的鹿茸活性组分；具体过程如下：1)新鲜鹿茸切碎，加入鹿茸质量5～30倍(最优范围为10～20倍)的去离子水，升温至90～100℃(最优范围为95～100℃)，搅拌提取1～5小时(最优范围为2～4)，提取结束后降至室温，用170～270(最优范围为200～230)目的滤网过滤，滤液即为提取物；2)用1～6M的HCl将提取物的pH调至1.0～5.0(最优范围为1.5～2.0)，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶A，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)；酶解结束后用1～6M的NaOH将pH调节至6.0～8.0(最优范围为6.5～7.5)，再加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶B，在20～80℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)，反应结束后将温度升至90～100℃(最优范围为95～100℃)并保温10～30分钟后降至室温；3)上述酶解液以15000×g～25000×g的速度于4～8℃离心20～30分钟，收集上清液，用截留分子量...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳艳，叶明亮，于洋，晏嘉泽，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21