一种肿瘤干细胞培养基、分选方法和抑制其分化为肿瘤源性免疫细胞的方法技术

本发明专利技术涉及肿瘤干细胞分选和分化技术领域，尤其涉及一种肿瘤干细胞培养基、分选方法和抑制其分化为肿瘤源性免疫细胞的方法。该肿瘤干细胞培养基中包括细胞因子B27、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子和表皮细胞生长因子。该分选方法包括以下步骤：取对数生长期的肿瘤细胞，消化制成单细胞悬液；在微筏芯片(Microraft Arrays)中，培养至所述肿瘤细胞贴壁；取仅含有单个细胞的微筏(Microraft)置于细胞培养板中培养至肿瘤细胞形成全克隆形态，转移至肿瘤干细胞培养基中，即得。该方法较之于现在普遍应用的肿瘤干细胞分选方法更快捷、更方便、更准确。

A Medium for Cancer Stem Cells, a Method for Isolating and Inhibiting Their Differentiation into Tumor-Derived Immune Cells

The invention relates to the technical field of tumor stem cell sorting and differentiation, in particular to a culture medium of cancer stem cells, a sorting method and a method for inhibiting their differentiation into tumor-derived immune cells. The cancer stem cell culture medium includes cytokine B27, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor and epidermal growth factor. The sorting method includes the following steps: taking tumor cells in logarithmic growth phase and digesting them into single cell suspension; culturing them in microraft Arrays to adhere to the tumor cells; and culturing the microraft containing only one cell in cell culture plate to form full-cloned tumor cells and transferring them to the culture medium of cancer stem cells. This method is faster, more convenient and more accurate than the commonly used method of cancer stem cell sorting.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤干细胞培养基、分选方法和抑制其分化为肿瘤源性免疫细胞的方法
本专利技术涉及肿瘤干细胞分选和分化
，尤其涉及一种肿瘤干细胞培养基、分选方法和抑制其分化为肿瘤源性免疫细胞的方法。
技术介绍
肿瘤组织由实质和间质两部分构成，肿瘤实质是肿瘤细胞，是肿瘤的主要成分，具有组织来源特异性。间质部分包括间质细胞和非细胞成分，其中间质细胞中主要包括免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等。非细胞成分包括细胞外间质和分泌到细胞外的细胞因子等。所有的这些成分构成了复杂的肿瘤微环境。构成肿瘤组织的肿瘤细胞，尤其是恶性肿瘤，通过其特殊机制，经常逃避机体的免疫系统监视，而且在肿瘤进行性生长时，肿瘤患者的免疫功能受到抑制，免疫系统中的免疫细胞对于肿瘤细胞的识别及清除发生障碍，不能发挥正常的清除异己功能，从而发生肿瘤转移复发等现象。现有的肿瘤新药研发和临床治疗方法均基于此理论认知，包括放疗、化疗、手术、传统中医药和免疫疗法等，却收效甚微，仍无法避免肿瘤转移复发，人类肿瘤的死亡率及五年生存率并未得到明显改善。近年来有关肿瘤干细胞的理论认为，在肿瘤细胞中有一小部分细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能，具有干细胞特性，它们是肿瘤发生，转移和复发的根源。已经有文献证实，肿瘤组织中的血管并非机体正常血管迁移浸润形成，而是由肿瘤干细胞分化而来，并因此影响部分抗肿瘤药物的效果。还有研究表明，在某些情况下，肿瘤特异性抗体非但不能杀伤肿瘤细胞，反而会干扰特异性细胞免疫应答对肿瘤细胞的杀伤作用，具有促进肿瘤生长的作用，机理不详。由此，我们推测，具有多向分化潜能的肿瘤干细胞可以通过分化为诱导肿瘤免疫逃逸的“肿瘤源性免疫细胞”，进而抑制免疫系统对肿瘤的有效识别和杀伤，甚至促进肿瘤的发生和发展。对肿瘤元凶肿瘤干细胞研究的前提条件是获取肿瘤干细胞，目前获得干细胞的方法有单细胞克隆培养法、磁珠分选法、流式分选法等。其中，单细胞克隆培养采用极限稀释的方法，主观人为差异误差较大，费时费力，其余方法则需要特殊仪器、特殊药物抗体或特殊药物等，例如流式分选法需要流式机器分选，众多实验室并不具备购买如此大型机器的能力，其他方法所需要的特殊抗体、磁珠或药物以及操作过程都将对细胞产生不同程度的损伤。获得肿瘤干细胞后，现有的肿瘤干细胞培养基难以在保持肿瘤干细胞生理特征的同时避免其诱导分化，而肿瘤干细胞的多向分化潜能使其分化为不同类型的肿瘤细胞后，会对后续关于肿瘤细胞的研究产生干扰。
技术实现思路
针对现有的肿瘤干细胞培养基难以在保持肿瘤干细胞生理特征的同时避免其诱导分化，获得肿瘤干细胞的方法需要特殊仪器、误差较大、费时费力、对细胞有损伤的技术问题，本专利技术提供一种肿瘤干细胞培养基。以及，本专利技术还提供一种肿瘤干细胞的分选方法。以及，本专利技术还提供一种抑制肿瘤干细胞分化为肿瘤源性免疫细胞的方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下技术方案：一种肿瘤干细胞培养基，所述肿瘤干细胞培养基中包括细胞因子B27、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子和表皮细胞生长因子。本专利技术所提供的肿瘤干细胞培养基能够使肿瘤干细胞保持干细胞的活性，且不贴壁生长，从而能够培养成肿瘤球。该培养基还能避免对肿瘤干细胞分化的诱导，避免肿瘤干细胞分化为不同类型的肿瘤细胞后对肿瘤细胞的研究产生干扰。当实验者需要得到特定细胞时，通过特定的诱导方法进行定向诱导，即可得到预期的细胞群。优选地，所述肿瘤干细胞培养基中细胞因子B27的浓度为1.8～2.2％wt；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为18～22ng/mL；所述转化生长因子的浓度为18～22ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为18～22ng/mL。各细胞因子在上述浓度下，能更好地使肿瘤干细胞保持活性，并避免其分化。优选地，所述肿瘤干细胞培养基中还包括双抗，所述双抗在所述无血清培养基中的浓度为0.1～1.0％v/v。以及，本专利技术实施例还提供一种肿瘤干细胞的分选方法，具体包括以下步骤：步骤a、取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后加入培养基制成单细胞悬液；步骤b、将所示单细胞悬液均匀添加至微筏芯片中，培养至所述肿瘤细胞贴壁；步骤c、取仅含有单个细胞的微筏，将其置于预先加入培养基的细胞培养板中，使所述细胞培养板的每个培养孔中含有一个所述微筏，继续培养至所述微筏中的所述肿瘤细胞形成全克隆形态；步骤d、取步骤c中形成全克隆形态特征的肿瘤细胞，转移至上述肿瘤干细胞培养基中，培养得肿瘤干细胞悬液。本专利技术中的微筏芯片(MicroraftArrays)是一系列能够提供进行细胞分类、细胞隔离、长时间细胞分析和繁殖克隆种群的微孔，每个微筏(Microraft)中均可容纳较少数量的单个细胞。该芯片能够同时进行大量的肿瘤干细胞分选工作，使肿瘤干细胞的分选操作更加简便，并能够显著缩短成球时间，成本更低，微筏中能够仅含有一个细胞，可排除其他细胞的干扰，使分选更为准确。具体地，上述步骤a和步骤c中所述培养基为RMPI1640培养基。该培养基可以适应多种细胞的生长，包括肿瘤细胞。优选地，所述RMPI1640培养基中还包括5～10％v/v胎牛血清。优选地，所述RMPI1640培养基中还包括0.1～1％v/v双抗。上述步骤c中所述取仅含有单个细胞的微筏的具体操作为：用释放针刺穿并释放含有单个细胞的微筏后用磁棒吸取。以及，本专利技术实施例还提供一种抑制肿瘤干细胞分化为肿瘤源性免疫细胞的方法，其特征在于，向按权利要求4所述分选方法得到的肿瘤干细胞悬液加入细胞因子IL-2、IL-3、TGFβ或IL-6中的至少一种。该肿瘤源性免疫细胞为肿瘤干细胞分化而来的具有免疫细胞特性、能够使肿瘤细胞产生免疫逃逸机制的细胞。本专利技术通过使用优选的细胞因子，能够抑制肿瘤干细胞分化成具有免疫逃逸机制的肿瘤源性免疫细胞，从而为研究肿瘤治疗方法提供一种新的思路。附图说明图1本专利技术实施例常规培养的A549细胞形态；图2本专利技术实施例A549细胞DNA的STR分型检验；图3本专利技术实施例免疫荧光显示的A549细胞中CD133+CSCs；图4本专利技术实施例流式检测A549中CD133+CSCs含量；图5本专利技术实施例MicroraftArrays分选法所得的肿瘤干细胞；图6本专利技术实施例免疫磁珠法所得的肿瘤干细胞；图7本专利技术实施例96孔板极限稀释法所得的肿瘤干细胞；图8本专利技术实施例免疫磁珠法、96孔板极限稀释法以及MicroraftArrays分选法所得肿瘤干细胞培养至成球干细胞数目达到100时所需天数；图9本专利技术实施例MicroraftArrays分选法、免疫磁珠法以及96孔板极限稀释法所得肿瘤干细胞的成球实验结果；图10免疫荧光法测得本专利技术实施例MicroraftArrays分选法、免疫磁珠法以及96孔板极限稀释法所得肿瘤干细胞的CD133分子表达量；图11流式细胞术测得本专利技术实施例MicroraftArrays分选法、免疫磁珠法以及96孔板极限稀释法所得肿瘤干细胞的CD133分子表达量；图12本专利技术实施例MicroraftArrays分选法、免疫磁珠法以及96孔板极限稀释法所得肿瘤干细胞的CD133分子表达量对比；图13本专利技术实施例WesternBlot检测A549细胞及MicroraftArrays分选法所得肿瘤干细胞的相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤干细胞培养基，其特征在于，所述肿瘤干细胞培养基中包括细胞因子B27、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子和表皮细胞生长因子。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤干细胞培养基，其特征在于，所述肿瘤干细胞培养基中包括细胞因子B27、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子和表皮细胞生长因子。2.根据权利要求1所述肿瘤干细胞培养基，其特征在于，所述肿瘤干细胞培养基中所述细胞因子B27的体积百分浓度为1.8～2.2％；和/或所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为18～22ng/mL；和/或所述转化生长因子的浓度为18～22ng/mL；和/或所述表皮细胞生长因子的浓度为18～22ng/mL。3.根据权利要求1或2所述肿瘤干细胞培养基，其特征在于，所述肿瘤干细胞培养基中还包括双抗，所述双抗在所述培养基中的浓度为0.1～1.0％v/v。4.一种肿瘤干细胞的分选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤a、取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后加入培养基制成单细胞悬液；步骤b、将所示单细胞悬液均匀添加至微筏芯片中，培养至所述肿瘤细胞贴壁；步骤c、取仅含有单个细胞的微筏，将其置于预先加入培养基的细胞培养板中，使所述细胞培养板的每个培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛斌，贾娴娴，贾苗苗，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：河北,13