富集肿瘤干细胞的方法技术

一种富集肿瘤干细胞的方法，包括：制得一个具有型腔的用于富集肿瘤干细胞的载体，将载体的型腔开口向上放置，并置于6孔细胞培养板中，然后加入培养液使得载体完全浸没，二氧化碳培养箱孵育至少24小时。然后，向各个载体的型腔中加入肿瘤细胞悬液，室温下放置至少30分钟待细胞沉淀到型腔底部后，再向细胞培养板中加入用于富集肿瘤干细胞的培养基，二氧化碳培养箱培养4天。本发明专利技术提供的方法，便捷快速，还显著降低了对细胞样液中细胞浓度的要求，能获得高活性的大小统一可控的肿瘤细胞球，能有效提高肿瘤干细胞富集比率，其干性相关指标OCT4表达水平亦得到提高。

Methods of enriching cancer stem cells

A method of enriching the tumor stem cells includes a carrier for enriching the tumor stem cells with a cavity, placing the opening of the cavity of the carrier and placing it in the 6 Hole cell culture plate, then adding the medium to make the carrier completely soaked, and incubating the carbon dioxide incubator for at least 24 hours. Then, the tumor cell suspension was added to the cavity of each carrier for at least 30 minutes at room temperature. After the cell was deposited to the bottom of the cavity, the culture medium was added to the cell culture plate to enrich the tumor stem cells, and the carbon dioxide culture box was cultured for 4 days. The method provided by the invention is convenient and fast. It also significantly reduces the demand for cell concentration in the cell like fluid, and can obtain highly active and uniform controlled tumor cell spheres. It can effectively improve the ratio of cancer stem cell enrichment, and the expression level of the dry related index OCT4 is also improved.

【技术实现步骤摘要】
富集肿瘤干细胞的方法
本专利技术涉及一种富集细胞的方法，尤其涉及一种对肿瘤干细胞进行富集的方法，简化富集肿瘤干细胞的操作，缩短从肿瘤组织或分离的肿瘤细胞中富集肿瘤干细胞的时间，提高了肿瘤干细胞富集比率。
技术介绍
恶性肿瘤导致的死亡人数在发展中国家高居第二位，而在发达国家更是高居榜首，是发达国家的首要死亡原因(CACancerJClin，2011，61(2)：69～90)，严重威胁着人类的健康及生存。近年来，肿瘤干细胞(CancerStemCell，CSC)学说备受关注。该学说认为肿瘤干细胞促进了肿瘤生长，是恶性肿瘤的起源；并且能够耐受化疗和放疗等常用的肿瘤治疗手段，是肿瘤转移和复发的重要原因。早在150年前已经有人提出肿瘤干细胞的概念(CritRevOncolHematol，2004，51(1)：1～28)。近年来，大量研究证据证实了肿瘤干细胞的存在。1997年Bonnet等分离出表型为CD34+和C38-的白血病干细胞，首次在细胞水平上直观证实了肿瘤干细胞的存在(NatMed，1997，3(7)：730～737)。近几十年，随着科学技术及相关研究的发展，肿瘤干细胞的研究进展迅速，人们已证实在多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞，如：乳癌(IntJBiochemCellBiol，2012，44(4)：573～577)、卵巢癌(ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(7)：2358～2363)、前列腺癌(LabChip，2012，12(1)：182～189)、结直肠癌(Nature，2007，445(7123)：106～110)和脑肿瘤(CancerRes，2003，63(18)：5821～5828)等。肿瘤干细胞与正常组织干细胞具有相同特性，即均具备自我更新和多向分化潜能(CancerRes，2006，66(19)：9339～9344)。此外，肿瘤干细胞致瘤能力强，少量肿瘤干细胞就能在裸鼠体内形成肿瘤(BMCGastroenterol，2011，11：71)；对多种化疗药物，如阿霉素、氟尿嘧啶、环磷酰胺、依托泊苷及顺铂等有耐药性(CancerLett，2012，322(1)：70～77)；抗放疗(BMCCancer，2012，12：48)；有特异性表面标记分子，如CD44+(ProcNatlAcadSciUSA，2003，100(7)：3983～3988)、CD133+(Nature，2007，445(7123)：111～115)、CD44v6+(StemCells，2009，27(5)：1006-1020)和CD34+(CritRevOncolHematol，2004，51(1)：1～28)等。传统对待癌症的治疗模式是通过手术切除、化疗、放疗等方法，消灭大部分的癌细胞，但是如果占据总细胞数很小比例的肿瘤干细胞依然存在，即使其他大部分肿瘤细胞已经被消灭，癌症的复发依然会发生。因此，彻底地根除癌症需要首先消灭肿瘤干细胞。深入了解肿瘤干细胞的生物学特性、发展快速的富集和鉴别方法以及特殊的治疗手段对癌症的临床治疗有着重要的意义。目前，根据肿瘤干细胞的特性，可通过不同方法富集肿瘤干细胞，例如诱导EMT(epithelial-to-mesenchymaltransition)过程(JBiolChem，2012，287(23)：19516～19527)、低黏附培养系统(AmJPatho1，2012，180(3)：1159～1169)、低氧培养(PLoSOne，2012，7(2)：e30905)、化疗药物刺激(CellCycle，2012，11(14)：2691～2698)、侧群分选(OralOncol，2012，48(10)：913～914)等方法，这为肿瘤干细胞的干细胞特性及分化能力的具体机制以及针对肿瘤干细胞的靶向治疗等研究奠定了基础。但是，目前这些方法都无法实现快速富集较高比率的肿瘤干细胞。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种富集肿瘤干细胞的方法，简化富集肿瘤干细胞的操作，缩短从肿瘤组织或分离的肿瘤细胞中富集肿瘤干细胞的时间，提高了肿瘤干细胞富集比率。本专利技术的另一个目的在于提供一种富集肿瘤干细胞的方法，在较低的细胞种植密度条件下实现肿瘤干细胞的富集，以降低对细胞样液中细胞浓度的要求。本专利技术的再一个目的在于提供一种富集肿瘤干细胞的方法，以获得具有较高活性的肿瘤干细胞。本专利技术的又一个目的在于提供一种富集肿瘤干细胞的方法，提高干性相关指标OCT4的表达水平。一种富集肿瘤干细胞的方法，包括：向模具中加入加热的液体状成模基料，待温度下降，成模基料凝固，而得一个具有型腔的用于富集肿瘤干细胞的载体，将载体的型腔开口向上放置，并置于细胞培养板中(比如：6孔细胞培养板)，然后加入含有100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素的DMEM/F12培养液使得载体完全浸没，并置于37℃±0.5℃的二氧化碳培养箱孵育至少24小时后，去除培养液；然后，向各个载体的型腔中加入细胞浓度为5×105细胞/毫升的肿瘤细胞悬液(如：200微升～300微升)，室温下放置至少30分钟待细胞沉淀到型腔底部后，再向各个型腔内加入用于富集肿瘤干细胞的培养基，于37℃±0.5℃二氧化碳培养箱培养4天。本专利技术提供的富集肿瘤干细胞的方法，所用的模具系硅胶小球器，具有多孔结构，其一般含有81孔，每孔直径400微米。另一种富集肿瘤干细胞的方法，包括：向多孔的硅胶小球器中加入加热的液体状成模基料，待温度下降，成模基料凝固，而得一个具有型腔(还具有多孔结构)的用于富集肿瘤干细胞的载体，将载体的型腔开口向上放置，并置于细胞培养板中(比如：6孔板)，然后加入含有100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素的DMEM/F12培养液使得载体完全浸没，并置于37℃±0.5℃的二氧化碳培养箱孵育至少24小时后，去除培养液；然后，向各个载体的型腔中加入细胞浓度为5×105细胞/毫升的肿瘤细胞悬液(如：200微升～300微升)，并使得接种密度为1×105～1.5×105个细胞/型腔于室温下放置至少30分钟待细胞沉淀到型腔底部后，再向各个型腔所在细胞培养板中加入用于富集肿瘤干细胞的培养基，于37℃±0.5℃二氧化碳培养箱培养4天。本专利技术提供的富集肿瘤干细胞的方法，成模基料包括DMEM/F12培养基，还加入2w/v％～3w/v％的琼脂糖。本专利技术提供的富集肿瘤干细胞的方法，用于富集肿瘤干细胞的培养基以DMEM/F12为基础培养基，还加入：含有10微摩尔的ROCK1抑制剂Y-27632，5v/v％胎牛血清，2v/v％马血清和100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素，用量为2毫升～3毫升。本专利技术提供的富集肿瘤干细胞的方法，适用于样液中含有的肿瘤细胞如：但不限于人卵巢癌细胞系(OVCAR-3)、人结直肠癌细胞系(SW620)、人胰腺癌细胞系(PANC-1)和人前列腺癌细胞系(PC3)，分别以密度为2×104个/孔种植到6孔板中，培养基采用含有5v/v％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素的DMEM/F12培养基，然后将细胞培养板转移到37℃二氧化碳培养箱中进行培养。每隔两天换液一次，培养四天左右可达到100％融合，然后采用含0.25％EDTA胰蛋白酶消化传代，传代细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于包括：向模具中加入加热的液体状成模基料，待温度下降，成模基料凝固，而得一个具有型腔的用于富集肿瘤干细胞的载体，将载体的型腔开口向上放置，并置于细胞培养板中，然后加入含有100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素的DMEM/F12培养液使得载体完全浸没，并置于37℃±0.5℃的二氧化碳培养箱孵育至少24小时后，去除培养液；然后，向各个载体的型腔中加入200微升～300微升细胞浓度为5×10

【技术特征摘要】
1.一种富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于包括：向模具中加入加热的液体状成模基料，待温度下降，成模基料凝固，而得一个具有型腔的用于富集肿瘤干细胞的载体，将载体的型腔开口向上放置，并置于细胞培养板中，然后加入含有100单位/毫升青霉素和1克/毫升链霉素的DMEM/F12培养液使得载体完全浸没，并置于37℃±0.5℃的二氧化碳培养箱孵育至少24小时后，去除培养液；然后，向各个载体的型腔中加入200微升～300微升细胞浓度为5×105细胞/毫升的肿瘤细胞悬液，室温下放置至少30分钟待细胞沉淀到型腔底部后，再向各个型腔所在的所述细胞培养板中加入用于富集肿瘤干细胞的培养基，于37℃±0.5℃二氧化碳培养箱培养4天。2.根据权利要求1所述的富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于所述的模具系硅胶小球器，具有多孔结构。3.根据权利要求1所述的富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于所述的模具系硅胶小球器，含有81孔，每孔直径400微米。4.根据权利要求2或3所述的富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于所述的向各个载体的型腔中加入200微升～300微升...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓令，葛仁山，陈勇，李超，陈显武，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33