一种多聚体复合物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种多聚体复合物及其制备方法，以及其在T细胞标记、检测、细胞分选或活化中的用途，尤其是一种MHC I类的四聚体复合物。该四聚体复合物稳定、结构高度均匀，同时特异性高。

A Polymer Complex and Its Preparation Method

The invention provides a polymer complex and a preparation method thereof, as well as its application in T cell marking, detection, cell sorting or activation, in particular a tetramer complex of MHC class I. The tetramer complex is stable, highly uniform in structure and high in specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种多聚体复合物及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种多聚体复合物及其制备方法，以及其在T细胞标记、检测、细胞分选或活化中的用途，尤其是一种MHCI类的四聚体复合物。
技术介绍
T细胞是机体免疫系统最重要的细胞之一，是免疫反应的核心，参与免疫的识别、活化及反应阶段。但是T细胞不能直接识别游离的抗原，抗原必需经过抗原提呈细胞(如巨噬细胞)处理后，以小肽或其他小分子的形式组装到其MHCI类或MHCII类的分子上，并且表达在抗原提呈细胞的膜表面。如此形成的MHC-肽复合物才能被T细胞的抗原受体(TCR)结合，从而产生识别和活化。但是MHC-肽与T细胞上的TCR的结合是十分短暂的，天然情况下，还需要APC及T细胞上的辅助黏附分子来加强这种结合，基本无法检测抗原特异性的T细胞，阻碍了T细胞的研究和应用。近年来，出现了MHC-肽的多聚体技术，此技术提高了MHC-肽与T细胞上的TCR的结合的稳定性，对T细胞的检测、分选、活化或扩增具有及其重大的意义。多聚体，例如，专利CN101298478B公开了从I类MHC重组蛋白类似物形成的多聚体，所述的蛋白包含重链与T淋巴细胞CD8共同受体作用区中的至少一个改变，所述多聚体与抗原性肽形成复合物，可用于诊断和治疗目的。专利CN1708512A公开了一种嵌合MHC蛋白及包含至少两种嵌合蛋白的寡聚MHC复合物，所述嵌合蛋白包含来自一种MHC肽链或其功能性部分和来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域。专利CN101111520A公开了MHC寡聚体及其制备方法，所述的MHC寡聚体包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结合于所述复合物的肽结合沟内的肽，其中每个肽都具有容许所述功能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚化的修饰。专利CN106397549A公开了三种MERS-CoV特异性多肽，并且用相应多肽制备了MHC-四聚体。MHC多聚体的制备方法，例如，专利CN105884870A公开了一种O型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法，首先设计口蹄疫病毒多肽，采用ELISPOT和构建四聚体两种方法筛选和鉴定口蹄疫病毒多肽，构建荷兰猪SLA-2重链四聚体。专利CN05884869A公开了一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法。专利CN1511850A公开了一种MHC-肽抗体多聚体的制备方法，通过制备纯化的MHCI类分子的重链和轻链，把纯化产物注射到动物体内使其产生抗体，纯化后标记上荧光标记物再把标记的抗体与新工艺制备的MHC-肽单聚体混合，聚合成为MHC-肽抗体多聚体。该方法简化了多聚体的制备步骤，提高了生产效率，但是多聚体的特异性不高。因此，本专利技术提供了一种全新的MHCI类的四聚体复合物及其制备方法。该四聚体复合物稳定、结构高度均匀，同时特异性高。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，涉及一种多聚体复合物，包括：1)单体，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。优选的，本专利技术涉及一种多聚体复合物，包括：1)单体，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。优选的，所述的MHC分子α链胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述的MHC分子β2m链的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。为提高多聚体复合物与TCR结合的特异性，所述的单体还包括至少一个氨基酸的化学修饰、突变、插入和/或缺失。优选的，所述的多聚体复合物，还包括抗原肽。优选的，所述的多聚体复合物中所述的MHC分子为MHCI类分子或MHCII类分子，更优选的，所述的MHC分子为MHCI类分子。优选的，所述MHC分子α链胞外区的第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。优选的，所述MHC分子α链胞外区为HLA-A、HLA-B或HLA-C的α链胞外区。优选的，所述MHC分子α链胞外区的氨基酸序列为SEQIDNO：1(A*0201)所示氨基酸序列或包含与SEQIDNO：1所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个优选的技术方案中，所述MHC分子α链胞外区的氨基酸序列为SEQIDNO：12、13或14(A*0201)所示氨基酸序列或包含与SEQIDNO：12、13或14所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述MHC分子β2m链的氨基酸序列是包含SEQIDNO：2所示氨基酸序列或包含与SEQIDNO：2所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述MHCII类分子为HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的α和β链。优选的，所述抗原肽选自源自Epstein-Barr病毒的蛋白质或源自巨细胞病毒的蛋白质，或肿瘤相关蛋白。优选的，所述源自Epstein-Barr病毒的蛋白质为源自Epstein-Barr病毒的LMP2、LMP1、EBNA1、EBNA3、BMLF1、BRLF1、BALF4蛋白质，所述源自巨细胞病毒的蛋白质为巨细胞病毒的pp65、IE1、pp50蛋白质，所述肿瘤相关蛋白为p53等。优选的，所述MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链为非共价缔合或共价连接。进一步优选的，所述共价连接为经由二硫键连接。优选的，所述多聚体复合物至少包含一个单体。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述多聚体复合物包含四个单体，所述多聚体复合物为四聚体复合物。优选的，每个单体至少偶联一个生物素分子。优选的，所述生物素分子与所述单体之间通过短肽标签偶联。进一步优选的，所述短肽标签在所述MHC分子α链胞外区氨基酸序列的C端；更进一步优选的，所述短肽标签为Avi-tag，所述Avi-tag序列包含GLNDIFEAQKIEWHE(SEQIDNO：3)所示氨基酸序列或包含与SEQIDNO：3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。更优选的，所述的在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO：15所示。本专利技术的第二方面，涉及一种单体，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β链。优选的，所述的MHC分子α链胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。更优选的，所述的在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO：15所示。优选的，所述的MHC分子β2m链的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。优选的，所述的单体还包括至少一个氨基酸的化学修饰、替换、插入和/或缺失。优选的，所述的单体可连接抗原肽。优选的，所述的单体中所述的MHC分子为MHCI类分子或MHCII类分子。优选的，所述MHC分子α链胞外区第245位氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多聚体复合物，其特征在于，包括：1)单体，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。

【技术特征摘要】
1.一种多聚体复合物，其特征在于，包括：1)单体，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括MHC分子α链胞外区和MHC分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。2.一种多聚体复合物，其特征在于，包括：1)单体，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。3.根据权利要求1-2任一项所述的多聚体复合物，其特征在于，还包括抗原肽。4.根据权利要求1-2任一项所述的多聚体复合物，其特征在于，所述的MHC分子为MHCI类分子。5.根据权利要求1-2任一项所述的多聚体复合物，其特征在于，所述MHC分子α链胞外区的第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。6.一种制备多聚体复合物的单体，其特征在于，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链，或者，所述单体包括在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β链。7.根据权利要求6所述的单体，其特征在于，所述MHC分子α链胞外区的第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。8.一种编码权利要求6或7所述单体的核酸。9.一种包含权利要求8所述核酸的载体。10.一种包含权利要求9所述载体的表达菌。11.一种多聚体复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)表达和纯化在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链；(2)将步骤(1)获得的在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和MHC分子β2m链稀释复性，制备单体，其中，所述在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区与所述MHC分子β2m链的摩尔比为(2-2.5):1；(3)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芳，赵学强，芮魏，郑洪丽，林欣，
申请(专利权)人：清华大学，华夏英泰北京生物技术有限公司，上海赛傲生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11