一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用。所述的运载蛋白可以通过与外源目的蛋白融合，高效地携带外源目的蛋白进入外泌体中。本发明专利技术还提供了一种重组表达载体，可将待表达的外源蛋白肽段基因序列插入至所述的重组表达载体的多克隆位点上，实现高效、定向地使外源蛋白在细胞的外泌体中表达。同时，本发明专利技术还提供了一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法，可有效地将外源目的基因带入外泌体中，操作简单易行，工艺稳定，适用性好。通过所述的制备方法制得的外泌体含有外源目的蛋白，并具有很好的细胞通透性，转染细胞的效率高，同时可发挥外源目的蛋白的活性与功效，具有广阔的应用前景。

A carrier protein, recombinant expression vector, exosome, preparation method and Application

The invention provides a carrier protein, a recombinant expression vector, an exosome, a preparation method and application. The carrier protein can efficiently carry the foreign target protein into the exosome by fusing with the foreign target protein. The invention also provides a recombinant expression vector, which can insert the gene sequence of the foreign protein peptide segment to the polyclonal site of the recombinant expression vector, and realize the efficient and directional expression of the foreign protein in the exosome of the cell. At the same time, the invention also provides a preparation method for exosomes carrying exogenous proteins, which can effectively bring exogenous target genes into exosomes. The operation is simple, the process is stable and the applicability is good. The exosome prepared by the preparation method contains exogenous target proteins, has good cell permeability, high efficiency of transfection, and can exert the activity and efficacy of exogenous target proteins, which has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用。
技术介绍
1981年，Trams等在透射电镜下发现了一组比多泡体还要小的、直径在40～1000nm的囊泡样物质。1987年，Johnstone等命名这种膜泡为外泌体(exosomes)，这种囊泡是由细胞质膜凹陷形成的，因而其外膜与细胞膜为同样的物质，配体-受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来进入受体细胞。天然形成的外泌体本身可以携带诸如RNA，蛋白质等大量成分。这些特点使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药物包载系统的想法。外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。然而对于大分子蛋白质药物，用现在常用的电穿孔，转染，孵育等包载药物的手段则非常困难。同时，目前对于外泌体携带细胞内蛋白的机制仍不清楚，外泌体携带胞内物质都是随机的，如何让目的蛋白进入外泌体成为亟待解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种运载蛋白，该运载蛋白可以高效地携带外源目的蛋白进入外泌体。本专利技术的第二目的在于提供编码所述的运载蛋白的基因。本专利技术的第三目的在于提供一种分泌表达外源蛋白的重组表达载体，该重组表达载体可以使外源蛋白在细胞中表达并将其携带进入外泌体。本专利技术的第四目的在于提供一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法。本专利技术的第五目的在于提供所述的外泌体及其应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种运载蛋白，所述的运载蛋白可以高效地携带外源目的蛋白进入外泌体，其氨基酸序列如下所示(SEQIDNO.1)：MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVALDICSKNPCHNGGLCEEISQEVRGDVFPSYTCTCLKGYAGNHCETKCVEPLGLENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWVPELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKVAYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTLRFELLGCELNARKADLRRGADDREQ所述的运载蛋白包含与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可携带外源目标蛋白进入外泌体中。如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。所述的取代优选为与SEQIDNO.1所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。一种编码所述的运载蛋白的基因，其核苷酸序列如下所示(SEQIDNO.2)：atgccgcgcccccgcctgctggccgcgctgtgcggcgcgctgctctgcgcccccagcctcctcgtcgccctggatatctgttccaaaaacccctgccacaacggtggtttatgcgaggagatttcccaagaagtgcgaggagatgtcttcccctcgtacacctgcacgtgccttaagggctacgcgggcaaccactgtgagacgaaatgtgtcgagccactgggcctggagaatgggaacattgccaactcacagatcgccgcctcgtctgtgcgtgtgaccttcttgggtttgcagcattgggtcccggagctggcccgcctgaaccgcgcaggcatggtcaatgcctggacacccagcagcaatgacgataacccctggatccaggtgaacctgctgcggaggatgtgggtaacaggtgtggtgacgcagggtgccagccgcttggccagtcatgagtacctgaaggccttcaaggtggcctacagccttaatggacacgaattcgatttcatccatgatgttaataaaaaacacaaggagtttgtgggtaactggaacaaaaacgcggtgcatgtcaacctgtttgagacccctgtggaggctcagtacgtgagattgtaccccacgagctgccacacggcctgcactctgcgctttgagctactgggctgtgagctgaacgcaaggaaggcagacttgaggcgaggagcagatgacagagagcagtaa所述的运载蛋白在基因、蛋白或药物递送系统的应用，所述的运载蛋白与待表达的外源目的蛋白进行融合表达后，所述的运载蛋白可高效地携带所述的外源目的蛋白进入外泌体中。一种分泌表达外源蛋白的重组表达载体，所述的重组表达载体含有所述的运载蛋白，并在所述的运载蛋白的基因序列后面添加多克隆位点序列，可以使其他所携带的目的蛋白在多克隆位点插入，在动物细胞中融合表达，并被带入外泌体。所述的分泌表达外源蛋白的重组表达载体的构建方法：通过PCR扩增技术、限制性内切酶切割和T4DNA连接酶连接，在所述的质粒载体的多克隆位点上插入外源目的蛋白肽段基因序列。一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法，包括如下制备步骤：(1)构建含有所述的运载蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段的重组表达载体，得到含有融合蛋白的重组表达载体；(2)将所述的重组表达载体转染细胞；(3)培养阳性细胞，使阳性细胞分泌表达载有所述外源蛋白的外泌体；(4)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。步骤(1)的步骤具体为：将所述的运载蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段通过接头(linker)连接后，利用限制性内切酶切割，用T4DNA连接酶与表达载体进行连接，构建得到重组表达载体。其中，连接的顺序为运载蛋白的基因片段-接头-目的蛋白肽段基因片段。通过接头进行连接，使得运载蛋白不会在空间妨碍外源蛋白与靶标的作用。所述的外泌体的制备方法可适用于多种外源目的蛋白。所述的外源目的蛋白可以根据需要进行选择，例如EGFP蛋白、bFGF蛋白等。所述的接头(linker)的氨基酸序列优选为DSAGSAGSAG；其核苷酸序列进一步优选为gatagtgctggtagtgctggtagtgctggt。步骤(3)中所述的表达可以是稳定表达或瞬时表达。所述的表达载体优选为适合表达外源蛋白的载体，优选为pcDNA3.4。所述的分离优选为通过超速离心方法或外泌体提取试剂盒从所述的细胞培养上清中分离得到所述的外泌体。所述的超速离心方法的具体步骤优选为：(1)300g离心细胞培养上清10min，2000g离心细胞培养上清10～20min，弃沉淀留取第一上清液，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种运载蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种运载蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的运载蛋白，其特征在于：所述的运载蛋白包含与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可携带外源目标蛋白进入外泌体中。3.一种编码权利要求1或2任一项所述的运载蛋白的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.权利要求1或2任一项所述的运载蛋白在基因、蛋白或药物递送系统的应用，所述的运载蛋白与待表达的外源目的蛋白进行融合表达后，所述的运载蛋白携带所述的外源目的蛋白进入外泌体中。5.一种分泌表达外源蛋白的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体含有权利要求1或2任一项所述的运载蛋白，并在所述的运载蛋白的基因序列后面添加多克隆位点序列，使其他所携带的目的蛋白在多克隆位点插入，在动物细胞中融合表达，并被带入外泌体。6.一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：(1)构建含有权利要求1或2任一项所述的运载蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段的重组表达载体，得到含有融合蛋白的重组表达载体；(2)将所述的重组表达载体转染细胞；(3)培养阳性细胞，使阳性细胞分泌表达载有所述外源蛋白的外泌体；(4)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。7.根据权利要求6所述的携带外源蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤(1)的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢秋玲，熊盛，王凯，季煜华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44