定量鞭毛荧光标志物和标准品制造技术

本文公开了荧光标志物，其包含沿着所述荧光标志物的长度有规律地散布的已知数目的荧光标记的蛋白质拷贝。所述荧光标志物可用于在荧光显微术中定量荧光标记的样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量鞭毛荧光标志物和标准品与相关专利申请的交叉引用本申请要求2016年3月24日提交的美国临时申请号62/312,772在35U.S.C.§119(e)下的优先权利益，所述美国临时申请的内容通过引用以整体并入本文。
技术介绍
本专利技术涉及可以在荧光显微术中有用的荧光标志物和标准品。具体来说，本专利技术涉及可以在荧光显微术中有用的荧光标记的鞭毛。在各种不同的生物学方法中，生物分子标志物是有价值的工具。例如，DNA或蛋白质标志物对于在凝胶电泳这种生物医学科学中的常用操作中估算相应分子的尺寸和丰度来说，是不可缺少的。不幸的是，在执行荧光显微术这种在研究和诊断中使用的非常常见的方法时，没有等效的标志物可用于容易地估算目标分子的数目。在这里，我们公开了可以在荧光显微术中用作生物分子标志物的荧光鞭毛。所述荧光鞭毛通常包括以已知的周期性存在于所述荧光鞭毛中的重组荧光蛋白，换句话说，每单位长度的鞭毛具有已知数目的重组荧光蛋白。因此，在荧光鞭毛中，所述重组荧光蛋白具有已知的化学计量，使得可以测量来自于所述鞭毛的荧光并且可以容易地确定每个重组荧光蛋白的相对荧光。通过将所述荧光鞭毛的荧光与荧光标记的样品分子的荧光进行比较，可以相当容易地定量荧光标记的样品分子的数目。因此，所公开的荧光鞭毛在荧光测定法中可用作标志物标准品。
技术实现思路
本文公开了荧光标志物。所公开的荧光标志物可以在荧光显微术中使用，以便定量荧光标记的样品或以其他方式评估荧光标记的样品。所公开的荧光标志物通常包含管状或圆柱状生物结构，其维度使所述荧光标志物适合用于荧光显微术中。所述荧光标志物的生物结构可以包括但不限于蛋白质微管或包含蛋白质微管的宏观结构，如二联微管、轴丝或鞭毛(例如真核鞭毛)。所公开的荧光标志物的生物结构通常由至少一种结构蛋白(SP)的多个拷贝形成。例如，所述结构蛋白的多个拷贝可以彼此非共价地结合或组装，以形成所述生物结构，所述生物结构可具有螺旋构象。形成所述生物结构的适合的结构蛋白可以包括微管蛋白例如α-微管蛋白、β-微管蛋白或其组合例如异二聚体。所述荧光标志物的生物结构包含荧光标记的蛋白质(FP)的多个拷贝。所述荧光蛋白沿着所述生物结构的长度有规律地散布，因此可以说所述荧光蛋白在所述生物结构中表现出周期性。由于所述荧光蛋白沿着所述生物结构的长度有规律地散布，因此所述生物结构具有每单位长度的所述生物结构已知化学计量的荧光蛋白，并且通过测量所述生物结构的长度，可以估算所述结构中存在的荧光蛋白的数目。此外，可以测量所述荧光标志物的荧光强度并且可以计算每个荧光蛋白的强度。所述荧光标记的蛋白质可以包含融合蛋白、由融合蛋白构成或基本上由融合蛋白构成，所述融合蛋白包含荧光蛋白部分和与所述生物结构结合或在所述生物结构中组装所述融合蛋白的部分。所述融合蛋白的与所述生物结构结合或在所述生物结构中组装所述融合蛋白的部分，可以被称为所述融合蛋白的锚部分，其中该锚部分将所述荧光蛋白部分锚定到所述生物结构。所述荧光蛋白部分被直接地或通过肽连接物融合到所述锚部分，并且所述荧光蛋白部分可以被融合到所述锚部分的C-端、N-端或任何位置。用于所述生物结构的融合蛋白，例如作为所述融合蛋白的锚部分的适合的蛋白质或其变体，可以包括与微管结合的径向辐条(RS)蛋白或其变体，例如在所述生物结构是微管或包含微管和二联微管的宏观结构例如轴丝或鞭毛的情况下。适合的RS蛋白可以包括径向辐条蛋白3(RSP3)。用于所述生物结构的融合蛋白，例如作为所述融合蛋白的荧光蛋白部分的适合的蛋白质或其变体，可以包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(EGFP)、mNeonGreen蛋白(NG)、增强蓝色荧光蛋白(EBFP)、mCherry荧光蛋白、tdTomato荧光蛋白、增强蓝绿色荧光蛋白(ECFP)、Midoriishi-Cyan1蛋白、AmCyan1蛋白、Azami-Green蛋白、mAzami-Green1蛋白、ZsGreen1、增强黄色荧光蛋白(EYFP)、Venus蛋白、ZsYellow蛋白、Kusabira-Orange1蛋白和mKusabira-Orange1蛋白。正如指明的，本文中公开的融合蛋白可以包含与荧光蛋白或其变体的氨基酸序列相融合的鞭毛的径向辐条蛋白(RSP)或其变体的氨基酸序列。代替荧光蛋白部分，所公开的融合蛋白可以包含融合到衔接蛋白或衔接蛋白的一部分(即“衔接部分”)的锚部分，其中所述融合蛋白的衔接部分结合到荧光团标记物。适合的衔接蛋白可以包括生物素化的多肽，其结合到可包括非蛋白质荧光团标记物的链亲合素偶联的荧光团标记物。因此，所公开的荧光标记的融合蛋白可包含融合到生物素化的衔接多肽的锚部分，所述生物素化的衔接多肽结合到链亲合素偶联的荧光团标记物。本文中还设想了编码本文中公开的融合蛋白的氨基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可被可操作连接到启动子，例如在表达载体内。还设想了分离的细胞，其包含表达所述融合蛋白的表达载体。可以培养所述分离的细胞以便生产所述融合蛋白和/或包含所述融合蛋白的生物结构，例如在本文中公开的荧光标志物包含所述生物结构的情况下。所公开的荧光标志物可以任选地被固定在固体基底例如可以在荧光显微术中使用的显微镜载玻片上。因此，本文中还设想了用于执行荧光显微术的方法。所述方法利用本文中公开的荧光标志物，并且可以包括在执行荧光显微术时检测来自于所述荧光标志物或来自于其上固定有所述荧光标志物的固体基底的荧光，和/或对所述荧光标志物进行成像的步骤。在所公开的用于执行荧光显微术的方法中，可以将所公开的荧光标志物施加到固体基底例如显微镜载玻片。随后，可以在执行荧光显微术之前将荧光标记的样品施加到所述载玻片。然后可以检测来自于所述荧光标志物的荧光和/或可以将所述荧光标志物成像。然后，同时或不同时地，可以在执行荧光显微术时检测来自于所述荧光标记的样品的荧光和/或可以将所述荧光标记的样品成像。在所述用于执行荧光显微术的方法中，所述标志物的荧光标记物可以与所述样品的荧光标记物相同或不同。所述荧光标志物可以与所述荧光标记的样品分开成像，和/或所述荧光标志物可以与所述荧光标记的样品一起成像。附图说明图1.衣藻(Chlamydomonas)鞭毛中的9+2轴丝。(A、B)轴丝的横截面和纵断面。径向辐条(白色箭头)被锚定到9个外部双联管中的每一个，并且呈现为每96nm一对。(C)每个径向辐条含有两个RSP3，其C-端靠近辐条头部区域。96nm重复单元的数字演示源自于具有RSP3(左，EM数据库ID，5845；Oda等，2014)和具有RSP3-链亲合素(右，EM数据库ID，5847)的鞭毛的低温电子断层扫描图。箭头，链亲合素标签。标尺条，100nm。图2.RSP3-NG鞭毛比RSP3-GFP鞭毛更亮。(A)鞭毛中RSP3-FP丰度的蛋白质印迹分析。鞭毛样品从野生型(WT)、pf14(RSP3突变体)和表达RSP3-NG或RSP3-GFP转基因的pf14细胞收获。探测所述印迹的RSP3和IC78，外部动力蛋白臂亚基作为载样对照。(B)RSP3-NG(左)和RSP3-GFP(右)转基因细胞的活细胞荧光显微术。箭头，鞭毛。(C)在不带有(上图)和带有背景减除的图像中RSP3-NG和RSP3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光标志物，其包含由结构蛋白(SP)的多个拷贝形成的管状或圆柱状生物结构，所述生物结构包含沿着所述生物结构的长度有规律地散布的荧光标记的蛋白质(FP)的多个拷贝。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.24 US 62/312,7721.一种荧光标志物，其包含由结构蛋白(SP)的多个拷贝形成的管状或圆柱状生物结构，所述生物结构包含沿着所述生物结构的长度有规律地散布的荧光标记的蛋白质(FP)的多个拷贝。2.权利要求1的荧光标志物，其每96nm的所述生物结构长度包含2个FP。3.权利要求1或2的荧光标志物，其中所述结构蛋白以螺旋构型组装。4.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述结构蛋白包含微管蛋白。5.权利要求4的荧光标志物，其中所述微管蛋白是α-微管蛋白(SEQIDNO：6或其变体)、β-微管蛋白(SEQIDNO：7或其变体)或作为异二聚体的α-微管蛋白与β-微管蛋白的组合。6.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述生物结构是微管或二联微管。7.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述生物结构是蛋白质微管或蛋白质二联微管。8.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述生物结构是包含A-微管和B-微管的二联微管。9.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述荧光标记的蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含与荧光蛋白的氨基酸序列相融合的与微管结合的径向辐条蛋白(RSP)的氨基酸序列。10.权利要求9的荧光标志物，其中所述荧光蛋白的氨基酸序列被融合到所述RSP的氨基酸序列的C-端。11.权利要求9或10的荧光标志物，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)、mNeonGreen蛋白(NG)或其荧光变体。12.权利要求9-11任一项的荧光标志物，其中所述RSP是组装在微管结构中的径向辐条蛋白3(RSP3)或其变体。13.权利要求12的荧光标志物，其中所述RSP3包含SEQIDNO：1或其变体的氨基酸序列，所述变体与SEQIDNO：1具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。14.权利要求9-13任一项的荧光标志物，其中所述荧光蛋白包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：3或其变体的氨基酸序列，所述变体与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。15.权利要求9-12任一项的荧光标志物，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO：4或SEQIDNO：5或其变体的氨基酸序列，所述变体与SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。16.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述荧光标记的蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含与结合到荧光标记物的衔接蛋白的氨基酸序列相融合的径向辐条蛋白(RSP)的氨基酸序列。17.前述权利要求任一项的荧光标志物，其中所述生物结构是包含所述管状或圆柱状生物结构的多个拷贝的轴丝。18.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳异，杨品芬，
申请(专利权)人：马凯特大学，
类型：发明
国别省市：美国,US