一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗骨质疏松的多肽，其氨基酸序列为(Asp‑Ser‑Ser)6‑(D‑Tyr)‑Asn‑(D‑Trp)‑Asn‑Ser‑Phe‑(azaGly)‑Leu‑Arg(Me)‑Phe‑NH2((AspSerSer)6‑Kp‑10，SEQ ID NO：1)；本发明专利技术还公开了上述多肽的制备方法，其包括多肽的合成、多肽的切割以及多肽粗品的分离纯化，本发明专利技术还涉及上述多肽在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。本发明专利技术通过研究证明了敲除Gpr54或者Kiss1基因导致骨质疏松和破骨细胞过度活化，Kp‑10通过激活Gpr54抑制破骨细胞的分化，肌动蛋白环(actin‑ring)的形成以及骨吸收；(AspSerSer)6‑Kp‑10具有更好的骨靶向作用，在体内比Kp‑10更有效地治疗由于卵巢切除导致的骨质疏松，其为治疗破骨细胞相关疾病提供理论依据。

A polypeptide for the treatment of osteoporosis and its preparation and Application

The present invention discloses a polypeptide for the treatment of osteoporosis, and its amino acid sequence is (Asp Ser Ser) 6 (D Tyr), Asn (D Trp), Asn Ser Phe (azaGly), Leu Arg (Me) Phe Phe Phe Phe Phe Phe NH2 ((AspSerSer Ser 6 (Asp Ser The invention also discloses a preparation method of the said polypeptide, which includes the synthesis of the polypeptide, the cutting of the polypeptide and the classification of the crude polypeptide. The invention also relates to the application of the polypeptide in the preparation of drugs for treating osteoporosis. The present invention proves that knocking out Gpr54 or Kiss1 gene leads to osteoporosis and osteoclast overactivation, Kp_10 inhibits osteoclast differentiation, actin_ring formation and bone resorption by activating Gpr54; (AspSer) 6_Kp_10 has better bone targeting effect and is more effective than Kp_10 in treating osteoporosis caused by ovariectomy in vivo. It provides a theoretical basis for the treatment of osteoclast-related diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种用于治疗骨质疏松的多肽及其应用。
技术介绍
骨质疏松是最常见的骨相关疾病，也是发病率最高的疾病之一。据统计，50岁以后妇女骨质疏松的发病率约为50％，男性的发病率也高达20％，并且随着年龄的增长，发病率也随之上升。随着人口老龄化，我国骨质疏松症患者的数量已居世界首位，在过去的30年间，我国的骨质疏松症患者增加了300％。最新统计结果显示，我国骨质疏松患者达9000万，已成为严重的社会问题。破骨细胞的过度活化是造成骨质疏松的主要原因。妇女绝经之后，由于雌激素大量下降导致破骨细胞大量活化，破坏骨的微观结构，导致骨量不断下降，易发生骨折，这些都是骨质疏松疾病常见的症状。破骨细胞是由造血系统中单核/巨噬细胞分化而来的，成骨细胞和间充质细胞分泌的细胞因子M‐CSF调控单核细胞的增殖、生存和向破骨细胞前体分化。成骨细胞和间充质细胞表达的破骨细胞活化因子RANKL与破骨细胞前体细胞表面受体RANK结合，决定单核破骨前体细胞最终向破骨细胞分化的命运。Gpr54是G蛋白偶联受体中的视紫红质超家族一员。Gpr54的配体是Kissl基因表达的蛋白产物Kisspeptins(简称Kp)。Kiss1基因是在黑色素瘤中作为肿瘤抑制基因被发现，编码一个含145个氨基酸的蛋白，可被蛋白酶体切割，经剪切可生成由54个氨基酸组成的具有生物学活性的分泌肽，即kisspeptin-54，可进一步被酶切成kisspeptin-14，kisspeptin-13，Kisspeptin-10，都能与GPR54特异性结合而发挥生物学作用，是Gpr54的天然配体。其中Kisspeptin-10缩写Kp-10，是具有活性形式的最短的Kisspeptin，其是其中最小的生物活性肽，由10个氨基酸组成。通过基因敲除小鼠和临床病人遗传分析发现，Kiss1是Gpr54的天然配体，在下丘脑中高表达，多种物种中能调控黄体生成素(LH)的分泌，并且同样能调控GnRH的分泌，从而调控整个青春期的发生。kiss1/Gpr54能调控青春期发育，而骨骼的生长正是青春期发育的最显著的特点之一。因此，kiss1/Gpr54受体完全有可能调控骨质的重建，从而影响到如骨质疏松等疾病。但是，迄今为止这方面还没有任何相关文献报道。
技术实现思路
专利技术人在针对kiss1/Gpr54受体参与调控骨质的重建的研究中，发现缺失G蛋白偶联受体54(Gpr54)导致破骨细胞活化，骨质疏松，其天然配体Kp-10通过抑制破骨细胞的形成和功能，具有抗骨质疏松作用，(AspSerSer)6-Kp-10能更好地将Kp-10靶向骨，产生骨保护作用。本专利技术针对骨质疏松的治疗，提供了一种用于治疗骨质疏松的多肽Kp-10或(AspSerSer)6-Kp-10。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种多肽Kp-10在制备治疗骨质疏松的药物。本专利技术的第二个目的是提供一种多肽，其氨基酸序列为DSSDSSDSSDSSDSSDSSYNWNSFGLRF(SEQIDNO：1)所示，具体为(Asp-Ser-Ser)6-(D-Tyr)-Asn-(D-Trp)-Asn-Ser-Phe-(azaGly)-Leu-Arg(Me)-Phe-NH2(简称(AspSerSer)6-Kp-10)(如SEQIDNO：1所示)。本专利技术中所述的(AspSerSer)6-Kp-10，是将6个重复的天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸串联序列(AspSerSer)6结构连接在Kp-10的N端，其中(AspSerSer)6可以作为载体特异性靶向到骨表面。天然分泌的Kp-10在血清中容易降解，半衰期比较短，活性也较低。根据文献报道(TaijiAsami,NaokiNishizawa,YoshihiroIshibashi,KimikoNishibori,MasaharuNakayama,YasukoHorikoshi,Shin-ichiMatsumoto,MasashiYamaguchi,HirokazuMatsumoto,NaokiTarui,TetsuyaOhtaki,ChiekoKitada.SerumstabilityofselecteddecapeptideagonistsofKISS1Rusingpseudopeptides.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,22(2012):6391–6396)，将Gly和Arg分别做了修饰，大大提高了Kp-10的稳定性和活性。修饰后的Kp-10的结构如下：。其中6个重复的天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸串联序列(AspSerSer)6可以作为载体特异性靶向到骨表面，可以将小RNA、小分子化合物、多肽等特异性携带致骨表面，从而使药物作用靶标更明确，减少副作用。因此，本专利技术将(AspSerSer)6连接在Kp-10的N端，其可将Kp-10携带至骨表面发挥抑制破骨细胞活性的作用。本专利技术的第三个目的是提供一种用于治疗骨质疏松的多肽((AspSerSer)6-Kp-10)的制备方法，其包括如下步骤：步骤(1)多肽的合成；对树脂反应柱依次进行脱保护和脱保护洗涤；脱保护洗涤完成后，取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的缩合剂加入树脂反应器，再将适量的有机碱加入树脂反应器，进行反应；反应完成后对树脂反应器进行洗涤；重复脱保护、脱保护洗涤、反应和洗涤步骤，直到连完最后一个氨基酸；合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂；步骤(2)多肽的切割；将步骤(1)中获得的干燥树脂移至容器中，在该容器中加入切割液，恒温振荡，进行反应产物的切割，获得切割产物；将切割产物进行过滤，滤除树脂，收集滤液，将无水乙醚加入滤液中，析出白色固体，获得初级多肽粗品；将初级多肽粗品进行离心，去除上清液，然后对白色固体进行重复洗涤和离心；将洗涤后的白色固体进行干燥，获得多肽粗品；步骤(3)多肽粗品的分离纯化：超声溶解步骤(2)获得的多肽粗品，溶解完全后用滤膜过滤，将过滤好的多肽粗品进行制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行氧化；将氧化好的多肽粗品重新制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行冷冻干燥，获得多肽精品。为了进一步优化上述制备方法，本专利技术的技术措施还包括：进一步地，所述缩合剂选自HOBT、HBTU、TBTU中的一种，更优选为HBTU。所述有机碱选自二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)中的一种，更优选为NMM。所述树脂选自PAM、MBHA、Wang、2-Cl-Trt、Rink-Amide-MBHA中的一种，更优选为Rink-Amide-MBHA树脂。进一步地，所述步骤(1)多肽的合成包括如下具体步骤：1a)脱保护：在树脂反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气，抽干；1b)脱保护洗涤：向树脂反应柱中加入适量二甲基甲酰胺(DMF)，通氮气，抽干；1c)投料、反应：取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的HBTU加入树脂反应器，再加入适量的NMM，通氮气，抽干；1d)反应后洗涤：加入适量DMF，通氮气，抽干；1e)反应产物的检测：取树本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗骨质疏松的多肽，其特征在于，其具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗骨质疏松的多肽，其特征在于，其具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。2.一种如权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)多肽的合成；对树脂反应柱依次进行脱保护和脱保护洗涤；脱保护洗涤完成后，取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的缩合剂加入树脂反应器，再将适量的有机碱加入树脂反应器，进行反应；反应完成后对树脂反应器进行洗涤；重复脱保护、脱保护洗涤、反应和洗涤步骤，直到连完最后一个氨基酸；合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂；步骤(2)多肽的切割；将步骤(1)中获得的干燥树脂移至容器中，在该容器中加入切割液，恒温振荡，进行反应产物的切割，获得切割产物；将切割产物进行过滤，滤除树脂，收集滤液，将无水乙醚加入滤液中，析出白色固体，获得初级多肽粗品；将初级多肽粗品进行离心，去除上清液，然后对白色固体进行重复洗涤和离心；将洗涤后获得的白色固体进行干燥，获得多肽粗品；步骤(3)多肽粗品的分离纯化；超声溶解步骤(2)获得的多肽粗品，溶解完全后用滤膜过滤，将过滤好的多肽粗品进行制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行氧化；将氧化好的多肽粗品重新制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行冷冻干燥，获得多肽精品。3.根据权利要求2所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自HOBT、HBTU、TBTU中的一种；所述有机碱选自DIEA、NMM中的一种；所述树脂选自PAM、MBHA、Wang、2-Cl-Trt、Rink-Amide-MBHA中的一种。4.根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)多肽的合成包括如下具体步骤：1a)脱保护：在树脂反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气，抽干；1b)脱保护洗涤：向树脂反应柱中加入适量DMF，通氮气，抽干；1...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建如，刘明耀，罗剑，李珍惜，龚海熠，程义云，章涵堃，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：上海,31