本发明专利技术提供一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其步骤包括：步骤1.溶胀树脂；步骤2.脱除芴甲氧羰基保护基，步骤3.氨基酸的偶联反应，步骤4：多肽切割；步骤5：分离纯化；步骤6:多肽的表征；步骤7:肽与DNA的相互作用；本发明专利技术解决了现阶段多肽固相合成的存在的弊端，提高了偶联效率与合成产率，合成产率达到60％以上；本方法合成的五条多肽P1、P2、P3、P4、P5；利用反相高效液相色谱法将合成的各种肽进行分离纯化，使用质谱对目标肽进行表征，结果表明所合成的产物均为相应的目标肽，纯度均在95％以上；此外，所合成的多肽具有不同的结构，其中P3的序列结构可为以特定DNA为靶点的多肽类药物的设计提供了基础信息与支持。
【技术实现步骤摘要】
一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法。
技术介绍
小分子肽合成是蛋白质和多肽化学中的一个很活跃的领域，基本合成方法可分为液相合成和固相合成两大类。固相法是RobertBruceMerrifield在1963年提出的，现在称之为固相肽合成(SPPS)，是肽化学的一个重大突破。与传统的液相工艺相比，固相法具有很多优势，例如缩短了生产周期，且通常具有较高的得率和纯度。它在许多肽类药物研究的进程中起到重要作用。随着新缩合方法和新型树脂的出现，固相法的整体效率普遍地提高。在固相合成中，具有优良性能的载体往往是成功的关键，带有各种连接功能基的低交联聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂化学性质稳定，溶胀率适度，热稳定性和机械性能较好,是目前国内外最广泛使用的固相载体，而这其中又以王树脂的使用较为广泛。传统的树脂多以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS)为骨架，通过氯甲基化制得氯甲基化聚苯乙烯树脂(Merridield树脂，PS-CH2-Cl)，再通过与对羟基苯甲醇的反应引入功能基团；但是目前这样的树脂有以下的缺点：合成原料氯甲基化的聚苯乙烯反应中要用到强致癌的氯甲醚为原料；氯甲基化反应中会伴随氯甲基的多取代和二次交联，会影响到树脂的性能；此外，此方法合成的目标肽产率与纯度都不高。
技术实现思路
本专利技术提供一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其解决了现阶段多肽固相合成的存在的弊端，提高了偶联效率与合成产率，合成产率达到60％以上；本方法合成的五条多肽P1、P2、P3、P4、P5；利用反相高效液相色谱法将合成的各种肽进行分离纯化，使用质谱对目标肽进行表征，结果表明所合成的产物均为相应的目标肽，纯度均在95％以上；此外，所合成的多肽具有不同的结构，其中P3的序列结构可为以特定DNA为靶点的多肽类药物的设计提供了基础信息与支持。本专利技术解决其技术问题所采用的的技术方案为：一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，包括如下步骤：一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，包括如下步骤：步骤1：溶胀树脂：称取1.0～1.5g,担载量为0.38mmol/g的Fmoc-L-Gly-WangResin，置于洁净干燥的固相合成管中，加入15～30mL的DMF，通入氮气通搅拌30～40min后，减压抽滤除去DMF，再分别用15mL的DMF洗涤树脂三次，滤除溶剂即得到溶胀好的树脂；步骤2：脱除芴甲氧羰基保护基：避光条件下在步骤1中得到的溶胀好的树脂中加入20mL的脱保护试剂，之后充氮气搅拌10min后减压抽滤，再加入20mL脱保护试剂，通氮气搅拌25min后减压抽滤掉保护试剂，然后检测树脂是否脱除芴甲氧羰基保护基；脱除Fmoc保护基成功后，用20mL的DMF和20mL的甲醇交替对树脂洗涤7次，每次洗涤时间不低于3min；步骤3：氨基酸的偶联反应：氨基酸的偶联反应：称取0.45～0.68g的Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，0.16～0.23g的HOAT，置于50mL干燥洁净的小烧杯中，加入10～20mLDMF进行溶解，溶解后再加入0.14～0.22g浓度为0.815g/mL的DIC，混匀活化15min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤步骤2得到的树脂，每次加入10～20mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全；若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸；重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止；步骤4：多肽切割：所有的氨基酸偶联成功后，将最后一个氨基酸的保护基去除后，用甲醇进行洗涤，并用氮气吹干；将干燥的树脂与配置好的切割试剂混合，磁力搅拌3h；然后用砂芯漏斗抽滤，将滤液与100～125mL冰乙醚混合，置于冰箱中3-4h后取出，放入离心机，以3800r/min离心10min；用-10℃的冰乙醚30mL洗涤沉淀三次，并用氮气吹干，得到固体粉末即为固相合成的产物；并在-20℃保存。步骤5：分离纯化:取适量合成肽用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪RP-HPLC进行分离纯化；步骤6:多肽的表征:称取一定量的多肽，用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液完全溶解，定容于1mL容量瓶，得到多肽溶液,浓度5×10-4mol/L；吸取100μL配置好的多肽溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至1mL；此时多肽浓度为5×10-5mol/L；固定多肽浓度，在多肽溶液中分别滴加体积不同的1×10-3mol/L的Zn(NO3)2溶液，这样就制备出了一系列含有不同浓度锌离子的溶液，常温下存放一小时；之后用1.0mm规格的比色皿，设置响应时间为2s，步长是2nm，在190-320nm波长区间内对它们分别扫描，扫描速度为每分钟100nm，反复扫3次，绘制出圆二色谱图；步骤7:肽与DNA的相互作用：在锌离子与多肽浓度都为5×10-4mol/L的混合溶液中，分别滴加不同体积且浓度均为5.0×10-4mol/L的DNA溶液；室温下放置1小时；使用3mL规格的比色皿，设置λex＝227nm，狭缝宽度是10nm，扫描它们的荧光图谱。优选的，所述步骤2中检测树脂是否脱除Fmoc保护基的方法为：在溶胀好的树脂中加入5％茚三酮/无水乙醇溶液，置于沸水浴中加热，如果1min内，树脂变为深紫色或者黑色，则说明脱除Fmoc保护基成功；反之脱除Fmoc保护基失败，需要继续重复脱除Fmoc保护基步骤，直至脱除Fmoc保护基成功才能进行下一步反应；如果重复三次后，反应仍为完全，则需要用浓度为1mol·L-1含乙酸酐的DMF溶液进行封端处理。优选的，所述步骤5中反相高效液相色谱仪RP-HPLC的分离参数是：AgilentZorbax300SB-C18半制备柱9.4mm×250mm,5μm；流动相：C相为0.1％的TFA/乙腈，D相是0.1％的TFA/H2O；流动相梯度：在0～15min内,C相比例是20％～50％,在15min～35min内,C相比例是50％～20％；流速是每分钟1mL；柱温：25℃；检测波长：220nm或280nm。优选的，所述步骤6中0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液的制备方法为：把称量好的3.03g三羟甲基氨基甲烷用双蒸水溶解，然后定容到250mL，得到浓度为0.1mol/L的溶液；移取8.3mL的浓盐酸，定容到1000mL，得0.1mol/L的HCl溶液；将两种溶液按照一定的体积比混匀，调整该混合液的pH＝7.1即可。优选的，所述步骤6中1×10-3mol/LZn(NO3)2溶液的制备方法为：秤取1.5g的Zn(NO3)2.6H2O，用双蒸水溶解定容至500mL，然后将高浓度的溶液再稀释10倍即可。优选的，所述步骤7中5.0×10-4mol/LDNA溶液的制备方法为：用紫外测定吸光度的方法来确定DNA的浓度，将配置好的DNA溶液放在冰箱中冷藏备用。本专利技术提供一种结合DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：溶胀树脂：称取1.0～1.5g,担载量为0.38mmol/g的Fmoc‑L‑Gly‑Wang Resin，置于洁净干燥的固相合成管中，加入15～30mL的DMF，通入氮气通搅拌30～40min后，减压抽滤除去DMF，再分别用15mL的DMF洗涤树脂三次，滤除溶剂即得到溶胀好的树脂；步骤2：脱除芴甲氧羰基保护基：避光条件下在步骤1中得到的溶胀好的树脂中加入20mL的脱保护试剂，之后充氮气搅拌10min后减压抽滤，再加入20mL脱保护试剂，通氮气搅拌25min后减压抽滤掉保护试剂，然后检测树脂是否脱除芴甲氧羰基保护基；脱除Fmoc保护基成功后，用20mL的DMF和20mL的甲醇交替对树脂洗涤7次，每次洗涤时间不低于3min；步骤3：氨基酸的偶联反应：称取0.45～0.68g的Fmoc‑L‑Thr(tBu)‑OH，0.16～0.23g的HOAT，置于50mL干燥洁净的小烧杯中，加入10～20mL DMF进行溶解，溶解后再加入0.14～0.22g浓度为0.815g/mL的DIC，混匀活化15min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤步骤2得到的树脂，每次加入10～20mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全；若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸；重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止；步骤4：多肽切割：所有的氨基酸偶联成功后，将最后一个氨基酸的保护基去除后，用甲醇进行洗涤，并用氮气吹干；将干燥的树脂与配置好的切割试剂混合，磁力搅拌3h；然后用砂芯漏斗抽滤，将滤液与100～125mL冰乙醚混合，置于冰箱中3‑4h后取出，放入离心机，以3800r/min离心10min；用‑10℃的冰乙醚30mL洗涤沉淀三次，并用氮气吹干，得到固体粉末即为固相合成的产物；并在‑20℃保存。步骤5：分离纯化:取适量合成肽用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪RP‑HPLC进行分离纯化；步骤6:多肽的表征:称取一定量的多肽，用0.05mol/L的Tris‑HCl缓冲溶液完全溶解，定容于1mL容量瓶，得到多肽溶液,浓度为5×10‑4mol/L；吸取100μL配置好的多肽溶液，用Tris‑HCl缓冲溶液定容至1mL，此时多肽浓度为5×10‑5mol/L；固定多肽浓度，在多肽溶液中分别滴加体积不同的1×10‑3mol/L的Zn(NO3)2溶液，这样就制备出了一系列含有不同浓度锌离子的溶液，常温下存放一小时；之后用1.0mm规格的比色皿，设置响应时间为2s，步长是2nm，在190‑320nm波长区间内对它们分别扫描，扫描速度为每分钟100nm，反复扫3次，绘制出圆二色谱图；步骤7：多肽与DNA的相互作用：在锌离子与多肽浓度都为5×10‑4mol/L的混合溶液中，分别滴加不同体积的浓度为5.0×10‑4mol/L的DNA溶液；室温下放置1小时；使用3mL规格的比色皿，设置λex＝227nm，狭缝宽度是10nm，扫描它们的荧光图谱。...
【技术特征摘要】
1.一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：溶胀树脂：称取1.0～1.5g,担载量为0.38mmol/g的Fmoc-L-Gly-WangResin，置于洁净干燥的固相合成管中，加入15～30mL的DMF，通入氮气通搅拌30～40min后，减压抽滤除去DMF，再分别用15mL的DMF洗涤树脂三次，滤除溶剂即得到溶胀好的树脂；步骤2：脱除芴甲氧羰基保护基：避光条件下在步骤1中得到的溶胀好的树脂中加入20mL的脱保护试剂，之后充氮气搅拌10min后减压抽滤，再加入20mL脱保护试剂，通氮气搅拌25min后减压抽滤掉保护试剂，然后检测树脂是否脱除芴甲氧羰基保护基；脱除Fmoc保护基成功后，用20mL的DMF和20mL的甲醇交替对树脂洗涤7次，每次洗涤时间不低于3min；步骤3：氨基酸的偶联反应：称取0.45～0.68g的Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，0.16～0.23g的HOAT，置于50mL干燥洁净的小烧杯中，加入10～20mLDMF进行溶解，溶解后再加入0.14～0.22g浓度为0.815g/mL的DIC，混匀活化15min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤步骤2得到的树脂，每次加入10～20mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全；若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸；重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止；步骤4：多肽切割：所有的氨基酸偶联成功后，将最后一个氨基酸的保护基去除后，用甲醇进行洗涤，并用氮气吹干；将干燥的树脂与配置好的切割试剂混合，磁力搅拌3h；然后用砂芯漏斗抽滤，将滤液与100～125mL冰乙醚混合，置于冰箱中3-4h后取出，放入离心机，以3800r/min离心10min；用-10℃的冰乙醚30mL洗涤沉淀三次，并用氮气吹干，得到固体粉末即为固相合成的产物；并在-20℃保存。步骤5：分离纯化:取适量合成肽用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪RP-HPLC进行分离纯化；步骤6:多肽的表征:称取一定量的多肽，用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液完全溶解，定容于1mL容量瓶，得到多肽溶液,浓度为5×10-4mol/L；吸取100μL配置好的多肽溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至1mL，此时多肽浓度为5×10-5mol/L；固定多肽浓度，在多肽溶液中分别滴加体积不同的1×10-3mol/L的Zn...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵东欣，吕名秀，段群鹏，卢奎，马丽，刘广斌，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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