一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法，步骤如下：(1)取含有乳酸脱氢酶突变体核苷酸序列的工程菌，培养至OD600值为2.5～4.0，得种子液；(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10％/min时，补料；(3)当OD600值为20～30时进行诱导表达，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，降温至30℃，继续补料，培养至OD600值为70～90。本发明专利技术可大幅提高含可溶性乳酸脱氢酶突变体宿主菌的收获水平，且发酵工艺简便，成本低廉，可应用于大规模生产制备乳酸脱氢酶突变体，有很好的应用前景。

A High Density Fermentation Method for Exogenous High Expression Lactate Dehydrogenase Mutants

The invention discloses a high-density fermentation method for exogenous high-expression lactate dehydrogenase mutants. The steps are as follows: (1) engineering bacteria containing lactate dehydrogenase mutant nucleotide sequence are cultured to OD600 value of 2.5-4.0, and seed liquid is obtained; (2) seed liquid is taken and cultured in fermentation medium until dissolved oxygen value and pH value rise rapidly, and the increase range of pH is greater than 0.2/min and dissolved oxygen value is obtained. When the OD600 value was 20-30, IPTG with the final concentration of 0.5 mol/L was added, then the temperature was reduced to 30 C, and the feeding was continued until the OD600 value was 70-90. The invention can greatly improve the harvest level of host bacteria containing soluble lactate dehydrogenase mutants, and has simple fermentation process and low cost, and can be applied to large-scale production of lactate dehydrogenase mutants, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法
本专利技术具体涉及一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法。
技术介绍
乳酸菌发酵代谢中有一种乳酸脱氢酶(LDH)，这种酶以NADH作为辅酶，经过生化反应将丙酮酸还原成乳酸，同时将NADH氧化成NAD。LDH多用于生物转化体系中NAD的再生利用。在生物催化制备化学品反应中，大多数氧化还原反应都需要NAD或者NADH作为辅酶，而NAD和NADH价格昂贵，为了降低生产成本，生物催化反应中的辅酶大多需要循环再生。辅酶再生有多种方法，包括酶法、化学法、基因工程法等，其中酶法是研究最多和经济性最高的方法。在工业生产规模下生物催化反应中重复利用辅酶具有广阔的前景。高密度发酵培养是提高表达量的一种方式，但是由于发酵的过程非常复杂，受到许多因素的影响，如微生物生长所需营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶解氧浓度及补料方式等，因此，要通过高密度发酵实现高表达目标蛋白并不容易。目前乳酸脱氢酶的基因工程菌的高密度发酵培养研究却一直没有进展，仍达不到大规模生产的需求。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)取含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组菌，在培养基中培养至OD600值为3.0～5.0，得种子液；(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值上升幅度大于10％/min时，补料，当OD600值为20～30时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达，培养至OD600值为70～90，得发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)取含有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的重组菌，在培养基中培养至OD600值为3.0～5.0，得种子液；(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值上升幅度大于10％/min时，补料，当OD600值为20～30时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达，培养至OD600值为70～90，得发酵液。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)所述重组菌是重组大肠杆菌。3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述大肠杆菌是E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、E.coliTop10或E.coliJM109，优选E.coliBL21(DE3)。4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)所述培养基为LB培养基。5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)所述发酵培养基每1L包含如下组分：Tryptone5～7g，YeastExtract2.5～4g，NaCl0.5～1.0g，Na2HPO4·12H2O15～18g，KH2PO43.5～5g，NH4Cl2～3g，泡敌0.35～0.5ml，其余为水。6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)所述种子液与发酵培养基的体积比为1:15；和/或，步骤(2)中，诱导表达前的培养条件为：温度37℃、pH7.00、溶氧值大于30％；和/或，步骤(2)所述加料方法为恒速补加方法，补料速度为23ml/(h·L)；和/或，步骤(2)中，诱导表达的培养条件为：温度30℃、pH7.00、溶氧值大于30％；和/或，步骤(2)，所述补料培养基的组分包括：无水葡萄糖450～500g/L，MgSO4·7H2O22～25g/L，ZnCl20.06～0.075g/L，FeCl3·6H2O0.875～1.012g/L，CuSO4·5H2O0.05～0....

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琪，张骞，邱鹏，蒋飞，王洪，罗红，
申请(专利权)人：四川自豪时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51