一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。该发明专利技术依赖于遗传资源Lactobacillus bulgaricus的乳酸脱氢酶基因，在此基础上进行点突变并对基因序列进行密码子优化后，连接到表达载体上，构建重组质粒并导入大肠杆菌中，重组乳酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，离心收集的菌体经高压均质机破菌后，粗酶液可在低温下存放5天，活性无明显衰减。通过本方法制备的重组乳酸脱氢酶突变体与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上，且在高pH值下的活性损失更小，有更广的pH值适用范围。本发明专利技术在乳酸发酵制备及NAD/NADH循环中有广阔的应用前景。

A lactate dehydrogenase mutant gene LbLDH1 and its high expression in Escherichia coli

The invention relates to a lactate dehydrogenase mutant gene LbLDH1 and a fermentation method for its high expression in E. coli. The invention relies on the lactate dehydrogenase gene of Lactobacillus bulgaricus, which is a genetic resource. On the basis of point mutation and codon optimization, the gene sequence is linked to the expression vector, and the recombinant plasmid is constructed and introduced into E.coli. The recombinant lactate dehydrogenase mutant is soluble and highly expressed in E.coli. The centrifugally collected bacteria are broken by high-pressure homogenizer. After inoculation, the crude enzyme solution could be stored at low temperature for 5 days, and its activity did not decrease significantly. Compared with the recombinant lactate dehydrogenase without mutation and sequence optimization, the expression of recombinant lactate dehydrogenase mutant prepared by this method increased more than five times, and the loss of activity was smaller at high pH value, so the application range of pH value was wider. The invention has broad application prospects in lactic acid fermentation preparation and NAD/NADH cycle.

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法
本专利技术属于基因重组发酵
，具体涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因lbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。
技术介绍
NADH依赖的乳酸脱氢酶(LDH)是一种乳酸菌发酵代谢中的一个关键酶，其以NADH作为辅酶，经过生化反应将丙酮酸还原成乳酸，同时将NADH氧化成NAD。由于乳酸脱氢酶和丙酮酸的价格十分便宜，性质相对稳定，所以可以用于生物转化体系中NAD的再生。大约80％生物催化的氧化还原反应都需要NAD或者NADH作为辅酶，由于NAD和NADH价格十分昂贵，所以生物催化反应中的辅酶都需要进行循环再生，以减少体系中辅酶的用量并提高反应的经济性。辅酶再生有多种方法，包括酶法、化学法、基因工程法等，其中酶法由于具备最温和，最经济的优势，成为了目前的研究热点，所以其在工业生物催化反应中具有广阔的运用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种经优化后可以在大肠杆菌中高效可溶表达，且经过高压均质机处理后得到高酶活的粗酶液，用于生物催化反应中的辅酶再生。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：它是在将乳酸脱氢酶第63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种重组乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：它是在将乳酸脱氢酶第63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸的突变体。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于：所述突变体由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码。4.一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1，其特征在于：所述LbLDH1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.一种重组载体，其特征在于：它包括权利要求4所述的乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1；优选所述重组载体为重组pET-22b(+)载体、重组pET-28a(+)载体或重组pET-32a(+)载体。6.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求5所述的重组载体。7.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌；优选为重组E.coliDH5α、重组E.coliBL21(DE3)、重组E.coliTop10或重组E.coliJM109。8.一种利用权利要求6或7所述重组菌发酵的方法，其特征在于：取重组菌的单克隆，接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中培养过夜，取菌液接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中扩大培养后，再加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达；培养完成后，收集菌体，按菌体湿重与破菌缓冲液1:3～1:10的比例混合，搅拌均匀后，用高压均质机进行菌体破...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琪，邱鹏，蒋飞，张骞，王洪，罗红，
申请(专利权)人：四川自豪时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51