一种检测高通量抗生素残留的方法及微生物显色试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种检测高通量抗生素残留的方法及微生物显色试剂盒。本发明专利技术所述的方法是一种以动物源性食品中常见的单一或配伍使用的抗生素为检测目标，以微生物显色为原理的高通量快速检测其残留的初筛方法及试剂盒。所述方法以大肠埃希氏菌(Escherichia coil)作为指示菌，优化其微胶囊包埋条件，使其更适用于微生物显色法，并将包埋颗粒固定于96微孔板中，制成可同时对不同类别多种抗生素进行联合初筛的试剂盒，克服了因菌种活化耗时较长及液体菌种无法运输等问题。与现有抗生素残留检测方法相比，本发明专利技术操作更简便、快捷，成本低廉，结果准确且肉眼即可根据显色判断，无需借助大型仪器。

【技术实现步骤摘要】
一种检测高通量抗生素残留的方法及微生物显色试剂盒
本专利技术涉及抗生素残留的检测，具体涉及一种检测高通量抗生素残留的方法及其微生物显色试剂盒。
技术介绍
抗生素在畜禽集约化生产中起着预防和治疗疾病等作用，但滥用这些抗生素会使其通过动物体自身转移、富集进入人类食物链，最终导致人体产生抗药性，影响疾病治疗与康复。当前抗生素滥用情况依然存在且形势严峻；其中，高通量、快速的检测方法将成为未来检测发展趋势。目前，畜禽肉中主要残留的抗生素包括喹诺酮类、四环素类及氨基糖苷类等，其检测方法主要有色谱法、微生物检测法和免疫分析法等。微生物法作为最早的检测抗生素残留的方法具有成本低廉、操作简单、高通量等特点，而我国微生物显色法多用于牛奶中抗生素残留的检测，用此法在禽畜肉中检测抗生素残留的研究较少。目前畜禽肉中主要残留的抗生素包括喹诺酮类、四环素类及氨基糖苷类等，为了增强抗生素疗效，缩短病程，减少细菌耐药性，现在常常把两种或两种以上的抗生素联合使用。而现有方法中较为常用的色谱法，可以进行定性定量检测，结果灵敏准确，但设备投入大，检测成本高，不同样品前处理不同且复杂，很难做到不同类抗生素联合检测，适合于大型综合性实验室进行仲裁判定和确证。免疫分析法虽灵敏度高，但是检测成本昂贵，只能检测单一样品、单一抗生素，不易于高通量。相较于前两种方法微生物法由于成本低廉、操作简单、具有广谱性，不受抗生素种类的制约，可作为一种高通量抗生素初筛方法应用在农产品安全监管环节，并在中小型企业得到普及。微生物法是抗生素残留检测最早采用的方法，目前已有多种商品试剂盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我国国标TTC法，国标TTC法存在的问题较多，如灵敏度较低，操作繁琐，试验菌的制备时间长，不同菌株耐药性不同、灵敏度也不同等，而国外进口的试剂盒价格昂贵。目前国内外利用微生物显色原理开发的试剂盒多是用嗜热脂肪芽孢杆菌作为指示菌，它对抑制物质的敏感性较高，生长较为快速，主要用于牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的检测，但该菌对残留在禽、畜肉中的主要抗生素喹诺酮类不敏感。因此现有方法和菌种多适用于牛奶样品检测，而在禽畜肉中检测抗生素残留的研究较少。此外，食品工业生产具有量大、批次多、周期短的特点，如果每份样品都用HPLC方法检测，其检测费用惊人，且有时企业对于原料肉中抗生素的残留量并不需要特别精确的数值，只是想知道购进的肉中是否含有抗生素。因此，开发出一种操作方便、费用低、可检测禽、畜肉中抗生素残留的高通量快速微生物显色初筛方法势在必行。而其首要一环是筛选一个对多种抗生素，尤其是对喹诺酮类抗生素敏感且敏感性稳定、检出限低、生长迅速的指示菌，并研究如何最大限度的缩短菌种活化时间，提高菌种的使用率，达到快速检测的目的。
技术实现思路
本专利技术所述的方法是开发出一种以动物源性食品中常见的单一或配伍使用的抗生素为检测目标，以微生物显色为原理的高通量快速检测其残留的初筛方法及试剂盒。所述方法以大肠埃希氏菌(Escherichiacoil)作为指示菌，优化其微胶囊包埋条件，使其更适用于微生物显色法，并将包埋颗粒固定于96微孔板中，制成可同时对不同类别多种抗生素进行联合初筛的试剂盒，克服了因菌种活化耗时较长及液体菌种无法运输等问题。与现有抗生素残留检测方法相比，本专利技术操作更简便、快捷，成本低廉，结果准确且肉眼即可根据显色判断，无需借助大型仪器。其中，本专利技术可同时对禽畜肉中常见的喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类等抗生素进行联合初筛检测。本专利技术提供的一种检测高通量抗生素残留的方法，以大肠埃希氏菌为指示菌，检测禽畜肉中抗生素残留的微生物显色法。所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoil)的菌种保藏编号为CICC23657。本专利技术为了提高菌种显色效果，克服因菌种活化耗时较长及液体菌种无法运输等问题，进一步对所述指示菌进行微胶囊化处理；本专利技术经过研究发现，采用PVA微胶囊包埋法对指示菌进行微胶囊化后，其效果显著提升；尤其是选择PVA为包埋载体，硼酸-四硼酸钠组合为包埋交联剂，并在此基础上，进一步优化其包埋的具体条件。优选的，所述微胶囊包埋法具体为：制备重量百分比为8％-15％聚乙烯醇(PVA)的溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基溶液，灭菌处理后，加入大肠埃希氏菌的菌悬液，再将其缓慢滴入硼酸-四硼酸钠溶液中，然后于3～5℃静置5～7h，过滤获得的指示菌颗粒，洗净备用。更优选的，所述聚乙烯醇的重量百分比为9％～11％时，所述硼酸-四硼酸钠溶液的pH值为6，其包埋效果最优。其中，所述抗生素选自喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类中的一种或多种。尤其是如下表格中的抗生素种类，以及联用的抗生素种类。表1可检测的抗生素种类其中，所述禽畜肉预先进行提取，所述提取具体为：将禽畜肉进行均质处理后，加入pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行充分混匀；然后置于90～110℃的温度下水浴3～5min，高速离心取上清液。本专利技术提供的一种检测高通量抗生素残留的微生物显色试剂盒，包括微胶囊化的指示菌颗粒、检测液、禽畜肉样品提取液以及对照组；其中，所述指示菌颗粒中的指示菌为大肠埃希氏菌。其中，所述检测液为大肠埃希氏菌培养液与指示剂的混合液；优选的，所述检测液按重量份计，包括8～12份蛋白胨、2～4份牛肉浸膏、8～12份葡萄糖、4～6份NaCl、0.03～0.05份溴甲酚紫指示剂、800～1200份水；所述检测液的pH值为6.8-7.2；其中，所述禽畜肉样品提取液具体为pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲溶液；优选为pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。其中，所述对照组包括阳性对照组、阴性对照组以空白对照组；所述阳性对照组为抗生素标准溶液，所述阴性对照组为禽畜肉样品提取液；其中，所述阴性对照组采用的禽畜肉样品提取液中是无任何抗生素残留的；优选的，所述空白对照组为生理盐水。优选的，所述微生物显色试剂盒还包括可自由拆卸的96微孔板。其中，所述抗生素标准溶液中至少包括庆大霉素、链霉素、青霉素G、四环素、红霉素、罗红霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星；优选的，所述抗生素标准溶液的浓度为0.08～0.12ug/mL。其中，为了使其指示菌的显色效果更为突出，本专利技术进一步优化其微胶囊化的指示菌颗粒的包埋方法，具体采用如下方式获得：制备重量百分比为8％-15％聚乙烯醇(PVA)的溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基溶液，灭菌处理后，加入大肠埃希氏菌的菌悬液，再将其缓慢滴入硼酸-四硼酸钠溶液中，然后于3～5℃静置5～7h，过滤获得所述指示菌颗粒，洗净备用。其中，为了使其所述包埋效果更优，在优选采用PVA-硼酸-四硼酸钠为组合的包埋载体和交联剂外，进一步控制聚乙烯醇的重量比，以及硼酸-四硼酸钠溶液的pH值。优选的，所述硼酸-四硼酸钠溶液的pH值为6.5～7.5。当所述聚乙烯醇的重量百分比为9％～11％时，使用pH值为6的硼酸-四硼酸钠溶液，其包埋效果最优。所述硼酸-四硼酸钠溶液可采用如下方式配制：四硼酸钠溶液A：准确称取1.907g四硼酸钠加热溶于100mL蒸馏水中；硼酸溶液B：准确称取3.711g硼酸加热溶解于100mL蒸馏水中。pH6：取A液7mL和B液43mL进行混合。所述灭菌处理采用常规方式进行，例如121℃灭菌10min；然后冷却至30～40℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测高通量抗生素残留的方法，其特征在于，以大肠埃希氏菌为指示菌，检测禽畜肉中抗生素残留的微生物显色法。

【技术特征摘要】
1.一种检测高通量抗生素残留的方法，其特征在于，以大肠埃希氏菌为指示菌，检测禽畜肉中抗生素残留的微生物显色法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用PVA-硼酸-四硼酸钠的微胶囊包埋法对指示菌进行微胶囊化；优选的，所述微胶囊包埋法具体为：制备重量百分比为8％-15％聚乙烯醇(PVA)的溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基溶液，灭菌处理后，加入大肠埃希氏菌的菌悬液，再将其缓慢滴入硼酸-四硼酸钠溶液中，然后于3～5℃静置5～7h，过滤获得的指示菌颗粒，洗净备用；更优选的，所述聚乙烯醇的重量百分比为9％～11％时，所述硼酸-四硼酸钠溶液的pH值为6，其包埋效果最优。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗生素选自喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类中的一种或多种；优选的，所述禽畜肉预先进行提取，所述提取具体为：将禽畜肉进行均质处理后，加入pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲溶液进行充分混匀；然后置于90～110℃的温度下水浴3～5min，高速离心取上清液。4.一种检测高通量抗生素残留的微生物显色试剂盒，其特征在于，包括微胶囊化的指示菌颗粒、检测液、禽畜肉样品提取液以及对照组；其中，所述指示菌颗粒中的指示菌为大肠埃希氏菌。5.根据权利要求4所述的微生物显色试剂盒，其特征在于，所述检测液按重量份计，包括8～12份蛋白胨、2～4份牛肉浸膏、8～12份葡萄糖、4～6份NaCl、0.03～0.05份溴甲酚紫指示剂、800～1200份水；所述检测液的pH值为6.8-7.2；和/或，所述禽畜肉样品提取液具体为pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲溶液，优选为pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。6.根据权利要求4或5所述的微生物显色试剂盒，其特征在于，所述对照组包括阳性对照组、阴性对照组以空白对照组；所述阳性对照组为抗生素标准溶液，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：范维，高晓月，李莹莹，王守伟，郭文萍，陈淑敏，宋永青，李贺楠，王琳，赵文涛，陈超，任楠，
申请(专利权)人：中国肉类食品综合研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11