耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用制造技术

本发明专利技术从极端菌株耐辐射异常球菌中发现了一种具有降解复杂结构蛋白功能的基因KerA。本发明专利技术构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，能降解复杂结构蛋白质的功能，可用于蛋白酶催化生物降解及相关工业生产中。

【技术实现步骤摘要】
耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用
本专利技术属于生物降解
，涉及耐辐射异常球菌角蛋白酶KerA基因降解复杂结构的蛋白质、发挥碱性蛋白酶水解的功能。
技术介绍
酶作为一种重要的生物催化剂，在生物化学反应中发挥十分重要的作用，较化学催化剂，酶的催化作用所需条件温和。无论在蛋白质工程、细胞工程、基因工程和发酵工程都需要各种酶的参与，酶工程技术己成为生物工程技术的重要组成部分。其中，蛋白酶在工业酶中用得最多，约占用酶总量的60％，而碱性蛋白酶占37％。碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类蛋白酶的总称，属于丝氨酸蛋白水解酶类。微生物碱性蛋白酶一般在pH为7-11范围内有活性，最适pH多为9.5-10.5。多数微生物碱性蛋白酶不具有耐热性，在50-60℃维持较长时间便大量失活，只有少数菌株产生的碱性蛋白酶能够耐受70℃的高温。这些情况限制了碱性蛋白酶的使用范围，人们需要找到pH范围和温度范围更宽的碱性蛋白酶用于实际生产中。
技术实现思路
异常球菌属菌株分离于温泉、沙漠、冰山及南极等各种各样的环境，所有的异常球菌属物种均具有极强的胁迫逆境抗性及超强的环境适应性。在这种极端的环境下，这些微生物经过长期的选择压力下，进化出一系列适应该生境的基因种质资源。菌株基因组中丰富的功能酶编码基因值得进行更加深入的研究。本专利技术的目的是从耐辐射异常球菌Deinococcusradiodurans中发掘鉴定了一种用于复杂结构蛋白降解的碱性蛋白酶基因。通过如下研究，首次发掘鉴定了耐辐射异常球菌KerA基因(GeneID：RS01950；ProteinID：WP_027480084)可用于微生物催化的生物降解。具体研究工作如下：1、获得了含有KerA基因的重组工程菌株1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出KerA基因，基因序列号为：GeneID：RS01950。其大小为1599bp，该基因编码532个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整KerA基因的重组质粒pJET-KerA；2)将KerA基因连接于pET22b质粒上，该质粒含诱导型T7启动子和前导肽pelB，可将诱导表达的靶标蛋白释放到培养液中。构建完成的重组质粒pET22-KerA；3)将导入KerA基因的重组质粒pET22-KerA转入受体大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21-KerA(详见实施例1)；2、含有KerA基因重组工程菌株的生物降解检测实验及蛋白酶活性测定分析本专利技术进行了如下生物降解检测实验：1)平板降解圈实验：实验结果显示，表达KerA蛋白酶的重组工程菌株在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈。2)羽毛降解实验：实验证实，并KerA蛋白酶具有降解鸡羽毛的活性(详见实施例2)。结果说明，表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和鸡羽毛等复杂结构蛋白。本专利技术还进行了蛋白酶活性测定分析。30℃诱导培养条件下，工程菌BL21-KerA在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为137.1U/mg(详见实施例3)。羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸(详见实施例4)。序列表信息SEQIDNO.1：KerA基因的核苷酸序列。SEQIDNO.2：KerA的氨基酸序列。附图说明：图1工程菌株BL21-KerA与对照菌株BL21-22b的牛奶平板降解效果；图2工程菌株BL21-KerA与对照菌株BL21-22b对羽毛底物的降解效果。具体实施方式以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本专利技术作进一步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；穿梭质粒pET-22b：Novagen公司市售产品；大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。羽毛：为鸡羽毛采购于市场。实施例1耐辐射异常球菌KerA基因序列在大肠杆菌中的表达一、实验材料大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。PCR模板DNA：耐辐射异常球菌基因组DNA二、实验方法1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的KerA基因序列设计1对PCR特异性引物：KerA-F：5′ACCGGATCCGATGAACGCACGTCTCGTTGC3′KerA-R：5′ACCCTCGAGCTTCGTTTCGGTCAGGCTGT3′2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。反应条件：94℃10min，[94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-KerA，并测序验证；然后通过BamHI/XhoI双酶切获得含有粘性末端的KerA基因及含有T7启动子的pET-22b载体，将KerA基因连接于pET-22b载体上，构建大肠杆菌高表达载体pET22-KerA，将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。三、实验结果利用PCR技术成功克隆了耐辐射异常球菌KerA基因，成功构建了表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-KerA。含有pET-22b对照空质粒的E.coliBL21(DE3)命名为BL21-22b。四、实验结论完成表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株的构建。实施例2耐辐射异常球菌KerA蛋白酶活性初步分析一、实验材料重组工程菌株：实施例1得到的表达KerA基因的BL21-KerA菌株对照菌株：实施例1所述含空质粒的BL21-22b菌株。二、实验方法1平板降解圈实验1)挑去单克隆菌株接种于含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜2)将种子液转接于新的LB培养基，培养至对数生长期。制备含有1％脱脂乳的1％琼脂平板。将菌株在平板上进行点种，每隔12h测定水解圈直径及菌落直径，至稳定不变。3)计算平板上水解圈直径与菌落直径的比值H/C，初步评估菌株产蛋白酶能力。2羽毛降解实验用清水冲洗鸡羽毛，烘干备用。以羽毛为唯一碳源和氮源加入50mL无机盐培养基，高温灭菌。无机盐培养基：NaCl0.05％，K2HPO40.1％，KH2PO40.04％，MgCl2·7H2O0.01％，CaCl20.006％，pH7.5。将菌株种子液转接于以羽毛为唯一碳源和氮源加入无机盐培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔12h观测羽毛降解情况。三、实验结果平板降解圈实验结果显示，培养24h后表达KerA蛋白的菌株BL21-KerA在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈，对照菌株BL21-22b未见降解圈(图1)。羽毛降解实验显示，菌株BL21-KerA培养24h开始降解羽毛，72h后羽毛完全降解。对照菌株BL21-22b培养液中羽毛未见降解发生(图2)。四、实验结论表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和羽毛。实施例3耐辐射异常球菌KerA蛋白酶酶活测定实验一、实验材料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO:1所示序列的基因在催化生物降解中的应用。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO:1所示序列的基因在催化生物降解中的应用。2.权利要求1所述的应用，是作为蛋白酶在生物降解中用于复杂结构蛋白质的降解。3.权利要求2所述的应用，所述的降解反应是将蛋白质降解为多肽或氨基酸的催化反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，周正富，王劲，耿秀秀，张维，陈明，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11