The invention relates to a method for modifying template double-stranded polynucleotides, in particular for characterization using nanopore sequencing. The method generates multiple modified double-stranded polynucleotides from the template. These modified polynucleotides can then be characterized.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及修饰模板双链多核苷酸的方法,特别是用于使用纳米孔测序的表征。
技术介绍
有许多商业情况需要制备核酸文库。这通常使用转座酶实现。取决于用于制备文库的转座酶,可能需要可以使用文库之前在体外修复转座事件,例如在测序中。当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的核酸(例如,DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵,主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量多核苷酸并且需要大量用于信号检测的专用荧光化学品。跨膜孔(纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接电子生物传感器具有巨大的潜力。具体地,最近关注作为潜在的DNA测序技术的纳米孔。当跨纳米孔施加电势时,当如核苷酸等分析物在桶中暂时停留一段时间时,电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中,使单个多核苷酸链通过孔并且衍生出核苷酸的同一性。链测序可以涉及使用分子刹车来控制移动所述多核苷酸通过孔。国际申请号PCT/GB2014/052505(公开为WO2015/022544)公开了一种使用MuA转座酶和MuA底物群,以从模板双链多核苷酸产生多个更短的、经修饰的双链多核苷酸。可以设计修饰的多核苷酸,使得它们各自比原始模板多核苷酸更容易表征,例如通过链测序。MuA转座酶通过热灭活。
技术实现思路
本专利技术涉及修饰模板双链多核苷酸的方法,特别是用于使用纳米孔测序的表征。该方法从模板产生多个修饰的双链多核苷酸。然后可以表征这些修饰的多核苷酸。专利技术人惊奇地证明,可以使用转位酶从修饰的多核苷酸中除去MuA转座酶。这避免了加热使MuA转座酶失活的需要,其也可以灭活用于制备或表征 ...
【技术保护点】
1.一种用于修饰模板双链多核苷酸的方法,包括:(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触,每个底物在一条链的一端或两端包含突出端,使得转座酶将模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端,从而产生多个片段/底物构建体;和(b)使用转位酶从构建体中除去MuA转座酶,从而产生多个修饰的双链多核苷酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.25 GB 1609220.71.一种用于修饰模板双链多核苷酸的方法,包括:(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触,每个底物在一条链的一端或两端包含突出端,使得转座酶将模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端,从而产生多个片段/底物构建体;和(b)使用转位酶从构建体中除去MuA转座酶,从而产生多个修饰的双链多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法,其中在通过MuA转座酶产生构建体后,使转位酶与构建体接触。3.根据权利要求1所述的方法,其中在底物与模板多核苷酸接触之前,转位酶与底物结合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述转位酶是解旋酶。5.根据权利要求4所述的方法,其中解旋酶来自超家族1或超家族2。6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述解旋酶是以下家族之一的成员:Pif1样、Upf1样、UvrD/Rep、Ski样、Rad3/XPD、NS3/NPH-II、DEAD、DEAH/RHA、RecG样、REcQ样、T1R样、Swi/Snf样和Rig-I样。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法,其中所述解旋酶是UvrD解旋酶、Hel308解旋酶、Tral解旋酶、Tral子组解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法,其中所述解旋酶是Hel308解旋酶。9.根据权利要求8所述的方法,其中所述He1308解旋酶是He1308Mbu(E284C/S615C)-双马来酰亚胺PEG11(SEQIDNO:10,具有突变E284C/S615C,由双马来酰亚胺PEG11接头连接)。10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述转位酶是剥除酶。11.根据权利要求10所述的方法,其中所述剥除酶是INO80染色质重塑复合物或FtsK/SpoIIIE转运蛋白。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中每个构建体的两条链在一端由发夹环连接。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括连接分子刹车至在底物上的其它链。14.根据权利要求13所述的方法,其中在所述分子刹车与模板多核苷酸和MuA转座酶接触之前连接至在底物上的其它链...
【专利技术属性】
技术研发人员:戴维·杰克逊·斯托达特,詹姆斯·怀特,
申请(专利权)人:牛津纳米孔技术公司,
类型:发明
国别省市:英国,GB
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