方法技术

技术编号:20122401 阅读:49 留言:0更新日期:2019-01-16 12:52
本发明专利技术涉及修饰模板双链多核苷酸的方法,特别是用于使用纳米孔测序的表征。该方法从模板产生多个修饰的双链多核苷酸。然后可以表征这些修饰的多核苷酸。

Method

The invention relates to a method for modifying template double-stranded polynucleotides, in particular for characterization using nanopore sequencing. The method generates multiple modified double-stranded polynucleotides from the template. These modified polynucleotides can then be characterized.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及修饰模板双链多核苷酸的方法,特别是用于使用纳米孔测序的表征。
技术介绍
有许多商业情况需要制备核酸文库。这通常使用转座酶实现。取决于用于制备文库的转座酶,可能需要可以使用文库之前在体外修复转座事件,例如在测序中。当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的核酸(例如,DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵,主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量多核苷酸并且需要大量用于信号检测的专用荧光化学品。跨膜孔(纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接电子生物传感器具有巨大的潜力。具体地,最近关注作为潜在的DNA测序技术的纳米孔。当跨纳米孔施加电势时,当如核苷酸等分析物在桶中暂时停留一段时间时,电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中,使单个多核苷酸链通过孔并且衍生出核苷酸的同一性。链测序可以涉及使用分子刹车来控制移动所述多核苷酸通过孔。国际申请号PCT/GB2014/052505(公开为WO2015/022544)公开了一种使用MuA转座酶和MuA底物群,以从模板双链多核苷酸产生多个更短的、经修饰的双链多核苷酸。可以设计修饰的多核苷酸,使得它们各自比原始模板多核苷酸更容易表征,例如通过链测序。MuA转座酶通过热灭活。
技术实现思路
本专利技术涉及修饰模板双链多核苷酸的方法,特别是用于使用纳米孔测序的表征。该方法从模板产生多个修饰的双链多核苷酸。然后可以表征这些修饰的多核苷酸。专利技术人惊奇地证明,可以使用转位酶从修饰的多核苷酸中除去MuA转座酶。这避免了加热使MuA转座酶失活的需要,其也可以灭活用于制备或表征修饰的多核苷酸的任何其他酶或蛋白质。去除热灭活步骤还省去了用于加热样品的额外设备,例如热循环仪或水浴。因此,本专利技术提供了修饰模板双链多核苷酸的方法,包括:(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触,每个底物在一条链的一端或两端包含突出端,使得转座酶将模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端,从而产生多个片段/底物构建体;和(b)使用转位酶从构建体中除去MuA转座酶,从而产生多个修饰的双链多核苷酸。附图说明图1显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当在室温下在不存在酶的情况下孵育时,在转座体1(标记为1)或转座体2(标记为2)的上部和下部标记之间未观察到PhiX峰。图2显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当在75℃温育10分钟时,在转座体1(标记为1)的上部和下部标记之间观察到PhiX峰。图3显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当在75℃温育10分钟时,在转座体2(标记为1)的上部和下部标记之间观察到PhiX峰。图4显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当与Hel308Mbu-E284C/S615C-STrEP(C)(SEQIDNO:10,具有突变E284C/S615C,在其C末端连接有链霉亲和素标签)孵育时,在转座体1(标记为1)的上部和下部标记之间未观察到PhiX峰。图5显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当与Hel308Mbu-E284C/S615C-STrEP(SEQIDNO:10,具有突变E284C/S615C,在其C末端连接有链霉亲和素标签)孵育时,在转座体2(标记为1)的上部和下部标记之间观察到PhiX峰。图6显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。当与A)Hel308Mbu-E284C/S615C-STrEP(C)(SEQIDNO:10,具有突变E284C/S615C,在其C末端连接有链霉亲和素标签)或B)在75℃孵育10分钟时,在转座体2(标记为1)的上部和下部标记之间观察到PhiX峰。PhiX与经加热和Hel308处理的转座体2的比较。红色经过热处理,蓝色经过Hel308处理。图7显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。线1对应于对照样品(i),其在室温下在不存在转位酶的情况下孵育。没有观察到样品(i)的标记(tragmentation)峰。线2对应于已在75℃温育的样品(ii)。对样品(ii)在上标记和下标记之间观察到标记(tagmentation)峰。图8显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。线1对应于对照样品(i),其在室温下在不存在转位酶的情况下孵育。没有观察到样品(i)的标记(tragmentation)峰。线3对应于样品(iii),其在室温下与Hel308Mbu-E284C-STrEP(C)(具有突变E284C的SEQIDNO:10,其C末端连接有链霉亲和素标签)一起温育。对样品(iii)在上标记和下标记之间观察到标记峰。图9显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。线1对应于对照样品(i),其在室温下在不存在转位酶的情况下孵育。没有观察到样品(i)的标记(tragmentation)峰。线4对应于样品(iv),其在室温下与T4Dda-(E94C/F98W/C109A/C136A/A360C)(SEQIDNO:97,具有突变E94C/F98W/C109A/C136A/A360C、然后(ΔM1)G1G2(其中(ΔM1)G1G2=M1删除,然后加入G1和G2)一起孵育。对样品(iv)在上标记物和下标记物之间观察到标记峰。图10显示了Agilent2100Bioanalyser曲线。下标记标记为X,上标记标记为Y。线1对应于对照样品(i),其在室温下在不存在转位酶的情况下孵育。没有观察到样品(i)的标记(tragmentation)峰。线5对应于样品(v),其在室温下与UvrDEco-(E117C/M380C)-STrEP(具有突变E177C/M380C的SEQIDNO:122,其中链霉亲和素标签连接在C末端)孵育。对样品(v)在上标记和下标记之间观察到标记峰。图11显示样品1-3的通量的条形图(y轴标记=kb/纳米孔/小时)(样品1=在室温下与Hel308Mbu-E284C/S615C-STrEP(C)使用具有3′突出端的转座体孵育,样品2=在75℃温育10分钟,样品3=在不存在Hel308Mbu-E284C/S615C-STrEP(C)下室温温育)。图12显示了用于从构建体中去除MuA转座酶的转位酶的卡通图示。MuA转座酶(标记为A)与双链MuA底物(标记为B)结合,该底物在一条链的每个末端具有两个标记为C的突出端。在步骤1中,MuA将模板多核苷酸片段化并将双链MuA底物连接到一端,产生构建体D。在步骤2中,使转座酶(标记为E)在突出端之一处与构建体结合。在步骤3中,转位酶从构建体中除去MuA,产生修饰的双链多核苷酸。在步骤4中,将前导序列连接到双链多核苷酸上,所述双链多核苷酸具有预先结合的酶(标记为F),其能够控制多核苷酸通过纳米孔的运动。应理解的是,附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于修饰模板双链多核苷酸的方法,包括:(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触,每个底物在一条链的一端或两端包含突出端,使得转座酶将模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端,从而产生多个片段/底物构建体;和(b)使用转位酶从构建体中除去MuA转座酶,从而产生多个修饰的双链多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.25 GB 1609220.71.一种用于修饰模板双链多核苷酸的方法,包括:(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触,每个底物在一条链的一端或两端包含突出端,使得转座酶将模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端,从而产生多个片段/底物构建体;和(b)使用转位酶从构建体中除去MuA转座酶,从而产生多个修饰的双链多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法,其中在通过MuA转座酶产生构建体后,使转位酶与构建体接触。3.根据权利要求1所述的方法,其中在底物与模板多核苷酸接触之前,转位酶与底物结合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述转位酶是解旋酶。5.根据权利要求4所述的方法,其中解旋酶来自超家族1或超家族2。6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述解旋酶是以下家族之一的成员:Pif1样、Upf1样、UvrD/Rep、Ski样、Rad3/XPD、NS3/NPH-II、DEAD、DEAH/RHA、RecG样、REcQ样、T1R样、Swi/Snf样和Rig-I样。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法,其中所述解旋酶是UvrD解旋酶、Hel308解旋酶、Tral解旋酶、Tral子组解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法,其中所述解旋酶是Hel308解旋酶。9.根据权利要求8所述的方法,其中所述He1308解旋酶是He1308Mbu(E284C/S615C)-双马来酰亚胺PEG11(SEQIDNO:10,具有突变E284C/S615C,由双马来酰亚胺PEG11接头连接)。10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述转位酶是剥除酶。11.根据权利要求10所述的方法,其中所述剥除酶是INO80染色质重塑复合物或FtsK/SpoIIIE转运蛋白。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中每个构建体的两条链在一端由发夹环连接。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括连接分子刹车至在底物上的其它链。14.根据权利要求13所述的方法,其中在所述分子刹车与模板多核苷酸和MuA转座酶接触之前连接至在底物上的其它链...

【专利技术属性】
技术研发人员:戴维·杰克逊·斯托达特詹姆斯·怀特
申请(专利权)人:牛津纳米孔技术公司
类型:发明
国别省市:英国,GB

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