一种捕获基因组特定DNA片段的方法技术

本发明专利技术公开了一种捕获基因组中特定片段DNA的方法，包括以下步骤：(1)将待检测DNA和含有目标位点的sgRNA/基因编辑蛋白复合物结合；切割出特定目标DNA；(2)构建测序文库；(3)测序确定特定区域DNA序列；本发明专利技术无需用常规捕获技术的杂交结合，可快速地实现了特定目标区域DNA富集，避免了常规方法杂交富集步骤多、流程繁琐等缺点，检测结果也更精准。

【技术实现步骤摘要】
一种捕获基因组特定DNA片段的方法
本专利技术涉及一种捕获基因组特定DNA片段，用于后续DNA检测的方法。
技术介绍
人的基因组具有30亿个碱基，也就是3Gb，其中含有编码区、非编码区和一些调控区域。随着高通量测序技术的发展，对全基因组进行重测序的成本越来越低，人类第一个基因组花费了30亿美金，现在一个人的全基因组重测序已经在几千人民币，近十年测序成本降低了一万倍，成本降低非常快。然而在临床上，比如特定遗传病检测、携带者筛查、耳聋检测、多基因病检测、单基因病检测，并不是每个病例都需要进行全基因组测序，而只需要进行特定区域的检测，从而快速检测该特定区域是否有DNA水平的结构异常。目前市场上出现了特定片段测序的方法，基本实现的方法有以下三个方向：1、PCR：PCR反应的核心是通过特定引物和目标DNA在合适温度下的结合，从而在聚合酶的存在下进行扩增。采用PCR技术，对需要检测的片段进行扩增，然后对扩增产物进行测序检测。PCR方法简单方便，价格便宜，快速实现区域富集。该技术适用于几十个位点富集，当需要检测位点比较多的时候，要调整优化每一个PCR反应的引物在一个近似的温度，同时进行反应就会非常困难，因为每个引物区域由特定位点决定，而这些区域的GC含量不尽相同，因此并不适用于大规模的片段检测。2、RNA探针富集：美国安捷伦公司发布了通过合成RNA探针和基因组DNA杂交从而一次性获得全基因组所有基因外显子区域的技术。该方法的原理是，首先将基因组DNA进行随机破碎，补平、加A、链接接头、扩增6～7个循环，得到一个全基因组小片段的扩增文库，然后将文库DNA变性成单链DNA和全外显子区域互补的RNA探针进行杂交4～16个小时，RNA探针上有生物素标记，通过链霉亲和素标记的磁性颗粒进行结合，从而洗去不是靶标区域的DNA，剩余的DNA进行10～16个循环的PCR扩增得到了最终文库，该文库就可以通过高通量测序进行检测，一般全外显子+调控区域基本在50Mb左右，测序一个2G数据量左右，就可以对外显子和调控区域有全面的检测。该技术出现以后，科研和临床范围应用广泛，目前主要的供应商为安捷伦和罗氏公司。这个方法相较于PCR最大的优点，可以一次性对全部外显子区域进行富集，这是常规PCR、多重PCR技术都无法实现的。该技术也可以针对特定区域进行定制，灵活性也不错。但是该技术操作相较于PCR技术复杂很多，耗时长，需要3～4天，整个实验过程有两次PCR过程，虽然现在基本都采用高保障PCR聚合酶，但是也不排除多次PCR扩增过程中会人为引入碱基错配。3、DNA探针富集：市场上也有用双链DNA探针和目标区域杂交富集的技术。该技术的实现路线和RNA探针的基本一致，也是首先将基因组DNA进行随机破碎，补平、加A、链接接头、扩增6～7个循环，得到一个全基因组小片段的扩增文库，然后将文库DNA变性成单链DNA和全外显子区域互补的DNA探针进行杂交4～16个小时，探针上有生物素标记，通过链霉亲和素标记的磁性颗粒进行结合，从而洗去不是靶标区域DNA，剩余的DNA进行10～16个循环的PCR扩增得到了最终文库，该文库就可以通过高通量测序进行检测，一般全外显子+调控区域基本在50Mb左右，测序一个2G数据量左右，就可以对外显子和调控区域有全面的检测。相较于PCR技术的优缺点和RNA探针方法一致。相较于RNA探针，具有探针本身稳定较佳，但是和目标片段DNA结合能力上不如RNA。PCR直接扩增技术通量较低，一般来说基因组捕获都指以探针方式杂交获得的形式。这种技术有几个常见的缺点：1.对于临床开展技术难度大，操作复杂，需要进行严格的分区，不利于该技术的大规模开展；2.当样本量大的时候，样本之间容易交叉污染；3.探针的方法由于需要在65度的温度下探针和目标DNA进行长时间的杂交结合，才能成功获得目标片段，因此耗时长久。近年来，基于CRISPR/Cas的第三代基因编辑系统获得了长足的发展，该系统原本为细菌的获得性免疫系统，当细菌受到外源的侵袭时，细菌把特定片段序列记录下来，如果下次再受到这个外源侵袭，细菌会立即启动免疫系统快速识别外源侵袭，切割外源序列，从而保证自身安全。这套CRISPR/Cas9系统在这几年发展非常迅速，被广泛应用于基因治疗、针对遗传病、恶性肿瘤、胚胎治疗、核酸检测。
技术实现思路
为了克服现有中的上述问题，本专利技术提供了一种捕获基因组中特定DNA片段的方法，无需常规捕获技术的杂交结合，快速地实现了特定目标区域DNA富集，避免了常规方法杂交富集步骤多、流程繁琐等缺点，检测结果也更精准。一种捕获基因组特定DNA片段方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待检DNA与含有特定区域sgRNA探针/基因编辑蛋白复合物结合，温浴切割DNA；(2)特定片段DNA构建测序文库；(3)通过测序确定特定区域DNA序列。进一步地，所述的sgRNA探针为基因编辑蛋白识别特定片段所需的探针，探针序列与特定片段互补，特定片段是一个或是多个靶标，每一个特定片段至少需要前后两个探针，中间间隔距离根据后期的检测要求调整。进一步地，sgRNA探针/基因编辑蛋白复合物结合DNA后，37℃温浴30分钟，实现特定片段DNA切割。进一步地，所述方法还包括通过清洗、过柱去除非特定片段DNA的步骤。进一步地，构建测序文库的方法是：切割下来的DNA，通过T4DNA聚合酶、Klenowexo-、T4DNA磷酸激酶(T4DNAPNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种补平和增加碱基A，37℃反应20分钟；加入细菌碱性磷酸酶(BAP)1分钟后，75℃变性5～10分钟，待温度降低后加入DNA连接酶、DNA接头，20℃连接20分钟；纯化去除反应体系中的蛋白和缓冲液，构建DNA测序文库，直接用于后续检测；若测序文库浓度过低，通过PCR方法扩增富集。本专利技术首次采用CRISPR/Cas家族蛋白对于特定序列DNA的识别和切割能力，对于特定片段DNA同时设计多条～数百万条探针，sgRNA探针和Cas蛋白复合物快速识别特定片段DNA，37℃孵育30分钟，即可把待测DNA片段全部切割下来；从基因组切割下来的DNA，末端进行补平、加A，随后连接DNA接头，构建完成的DNA文库可以通过测序仪进行测序。测序仪可以是以边合成边测序为主要技术代表的二代测序仪(illumina、Life)，也可以是PacBio、OxfordNanopore等为代表的第三代单分子测序仪。常规探针富集杂交技术中，杂交步骤需要65度4～16个小时，一般以过夜杂交为多，费时费力。本方法首次采用了基因编辑方法去识别DNA并从待测DNA上把需要检测的区域DNA切割下来，构建测序文库，从而首次实现了多重靶标DNA富集，无需常规的探针过夜杂交过程，最快可在两个小时内完成了特定片段富集及测序文库构建，比常规的探针富集方法要节约90％的时间。常规探针捕获方法是通过重叠的过量探针和一个DNA混合文库进行杂交，把结合在目标区域的DNA最后洗脱下来，不能控制洗脱DNA的原始长度，从而在后期检测的时候就需要用尽可能长的DNA测序方法，把洗脱下来的DNA进行全长测序，才能准确的获得待检测区域的DNA变异情况。而本专利技术由于特定的切割位点已定，可以定制出符合后续检测要求的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种捕获基因组特定DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待检DNA与含有特定片段sgRNA探针/基因编辑蛋白复合物结合，温浴切割DNA；(2)特定片段DNA构建测序文库；(3)通过测序确定特定片段DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种捕获基因组特定DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待检DNA与含有特定片段sgRNA探针/基因编辑蛋白复合物结合，温浴切割DNA；(2)特定片段DNA构建测序文库；(3)通过测序确定特定片段DNA序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA探针为基因编辑蛋白识别特定片段所需的探针，探针序列与特定片段互补，特定片段是一个或是多个靶标，每一个特定片段至少需要前后两个探针，中间间隔距离根据后期的检测要求调整。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA探针/基因编辑蛋白复合物结合DNA后，37℃温浴30分钟，实现特定片段DNA切割。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王珺，
申请(专利权)人：杭州恺思医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33