本发明专利技术提出了一种基于三螺旋分子信标的可同时检测两种HIV DNA序列的荧光探针。两个探针序列(2‑AP序列和G‑四链体序列)分别被cDNA1和cDNA2的茎部锁住，表现为弱荧光状态。当加入目标物HIV‑1和HIV‑2时，目标物HIV‑1和HIV‑2分别与cDNA1和cDNA2部分互补配对，破坏三螺旋的稳定结构，将分子信标打开，释放出探针序列。因此由于释放出2‑AP或者通过在释放后形成的G‑四链体中嵌入染料硫磺素T(THT)而使荧光得到回升。该荧光探针可用于对目标HIV DNA进行高灵敏度、高选择性的检测。其对HIV‑1的检出限为227pM，对HIV‑2则为352pM。此外，其可用于真实生物样品中HIV DNA的检测，并表现出极好的回收结果，这为在生物流体中特异性检测HIV DNA提供了巨大潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种基于三螺旋分子信标的可同时检测两种HIVDNA序列的荧光探针
本专利技术涉及一种基于检测HIV基因的荧光探针，属于分子检测领域。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染并破坏宿主的免疫系统时，免疫系统的功能会逐渐丧失并伴随着许多疾病的发生，严重时还会导致死亡。因此，精确的检测HIV基因对于感染者的及早发现与及时治疗具有重要的意义。目前，HIV基因的检测方法层出不穷，但还存在一些不足之处，例如，比色法灵敏度较低。电化学法重现性、选择性差，，其应用受到限制。传统荧光法一般需要将探针链两端标记，或者利用荧光共振能量转移(FRET)机理使染料基团发生荧光淬灭。该方法实验体系复杂，费用昂贵。后来，Werner等人发现当AgNCs在接近富含鸟嘌呤(G-rich)的DNA序列时，两者会相互作用，AgNCs较弱的荧光会出现明显增强[Yeh,H.C.；Sharma,J.；Han,J.J.；Martinez,J.S.；Werner,J.H.NanoLett.2010,10,3106-3110]。这个重要的发现被不断改进，并得到了广泛的应用。然而，该方法一般需要较长的合成时间且需要暗室操作，使其应用受到了严重的限制。本方案发展了一种可解决Werner等人提出的方法所存在的合成时间长、合成条件苛刻等问题。本方案是使用对光稳定的铜纳米粒子替代AgNCs作为检测HIV基因的荧光探针，快速简便且免标记的实现了HIV基因的灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计一种简单经济、操作方便的荧光生物探针，高灵敏、高选择性的实现特定HIV基因的检测。为了实现上述目的，本专利技术设计了一种双G-四链体点亮铜纳米粒子的荧光探针来检测HIV基因：(1)荧光探针的制备：将0.5μM含有聚AT的dsDNA和1μMcDNA加入到10mM的MOPS缓冲液中(150mMNaCl，pH7.5)。将混合溶液在90℃恒温水浴锅中加热约10分钟，然后缓慢冷却至室温。然后在杂交产物中混入500μMCuSO4和2mML-抗坏血酸(AA)，继而在25℃水浴锅中孵育5分钟即可形成。(2)荧光实验检测方法：所有的检测实验在10mM的MOPS缓冲液中进行(150mMNaCl，pH7.5)。在最佳优化条件下，40μL的dsDNA(0.5μM)和40μL的cDNA(1μM)混合在一起，然后在90℃水浴下加热10min后冷却至室温，AA(2mM)和硫酸铜(500μM)加入后开始孵育。随后，将各种浓度的HIV-DNA加入上述溶液反应30min，最后加入20μL的K+使最终体积达到200μL。反应60min后，记录荧光强度。进一步的，检测仪器设置为，激发波长：340nm，发射波长：550nm；激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：10.0nm。通过荧光光谱法，测得其对HIV基因的检出限为130PM。附图说明【图1】为本专利技术的检测目标物方法的工作原理图。【图2】为荧光光谱可行性分析图。【图3】为圆二色谱表征图。【图4】为紫外-可见光谱可行性分析图。【图5】为实验条件优化图。【图6】为荧光光谱图。【图7】为线性关系图。【图8】为选择性验证图【图9】为人血清样品的加标回收率表。【图10】为本实验中所需的探针序列具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若无特别说明，本专利技术中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。实施例1一种基于检测HIV基因的荧光探针的原理设计如图1所示，该探针包含两种核酸链：一个是与目标物HIV-DNA互补结合链，在这项工作中被指定为“cDNA”。另一种是荧光探针的合成链，命名为“P”，聚AT的dsDNA中一部分包含了丰富的鸟嘌呤序列，在K+等作用下可折叠成G-四链体。起初，cDNA与富G序列通过碱基错配而不能折叠，序列成锁住状态。在无目标物的情况下，G-四链体不发挥作用，因此合成的铜纳米粒子表现较弱的荧光信号。当加入目标物后，目标物HIV-DNA可以将cDNA竞争下来，从而释放出的富G序列就可以折叠成G-四链体，G-四链体具有点亮铜纳米粒子荧光的能力。随着加入的目标物越来越多，释放的G-四链体也会越来越多，对铜纳米粒子的作用也就更大，荧光就会随着HIV-DNA的加入而升高。因此，荧光强度的变化即可影射出目标物的变化，并通过公式可计算出最低检测限。实施例2一种基于检测HIV基因的荧光探针的可行性测定(1)荧光光谱测试测试环境在10mM的MOPS缓冲液中进行(150mMNaCl，pH7.5)。最佳优化条件下，40μL的dsDNA(0.5μM)和40μL的cDNA(1μM)混合在一起。在90℃水浴加热10分钟后冷却至室温，AA(2mM)和硫酸铜(500μM)加入后开始孵育。随后，各种浓度的HIV-DNA进入溶液反应30分钟，20μL的K+最后加入使最终体积达到200μL。最后，反应60分钟后记录荧光强度。检测条件：激发波长：340nm，发射波长：550nm；激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：10.0nm。如图2所示，由下至上，当只对dsDNA-CuNPs的荧光进行分析时，得到了一种微弱的荧光强度。当加入钾离子时，荧光强度基本没有变化，这表明cDNA已经比较稳固的锁定了富G序列。当目标物和K+同时加入到溶液中时，荧光强度显著增加。这表明HIV-DNA成功竞争cDNA，并释放富G序列，富G序列在钾离子的存在下折叠成G-四链体，从而增强了dsDNA-CuNPs的荧光强度。因此，可以证明我们的策略是合理的。(2)圆二色谱(CD)测定圆二色谱在CD旋光仪上进行表征(Chirascan，AppliedPhotophysics，UK)。在MOPS(10nM的MOPS，150mMNaCl，pH7.5)缓冲溶液中制备一组cDNA/探针双螺旋杂交链(2μM)，另一组为加入HIV-DNA的cDNA/探针双螺旋杂交链(2μM)。在200和350nm之间记录两组数据。条件：1mm的光比色皿光谱，记录速度100nm/min，响应时间为0.5秒钟，带宽为1nm。三次测量每个样品，平均3次扫描光谱。如图3所示，没有目标物的时候，cDNA/探针杂交双链表现出的特征峰为正270nm和负245nm，这是由于cDNA与P部分杂交，使部分G序列呈游离状态。在目标HIV-DNA加入后，CD上正负特征峰的强度增加，这是由于形成了目标/cDNA双螺旋，从而释放出更多的富G序列形成了G-四链体。(3)紫外吸收光谱测定如图4所示，比较双链+AA和双链+AA+Cu2+的紫外吸收光谱可以发现：后者在340nm处有特定且明显的吸收峰，而前者在该区域没有明显的峰谱出现，该紫外表征图说明合成dsDNA-CuNPs的条件是双链DNA、Cu2+和AA，且三者缺一不可实施例3一种基于检测HIV基因的荧光探针的优化性实验如图5所示，为了使设计的实验方案达到最佳的传感性能，该实验对反应的pH值、反应时间、AA浓度、Cu2+浓度、K+浓度等进行了优化。在酸性条件下，只检测到微弱的荧光强度，而在pH值为7.5时获得了dsDNA-CuNPs最佳的荧光强度。AA作为合成铜纳米粒子的还原剂，在整个合成过程中是个关键因素，结果表明，随着AA浓度的增加，铜纳米粒子的荧光强度明显增强，并在AA的浓度为2mM时达到最高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于以下合成步骤：(1)将0.5μM含有聚AT的dsDNA和1μM cDNA加入到10mM的MOPS缓冲液中(150mM NaCl，pH 7.5)。(2)将混合溶液在90℃恒温水浴锅中加热约10分钟，然后缓慢冷却至室温。(3)在杂交产物中混入500μM CuSO4和2mM L‑抗坏血酸(AA)，继而在25℃水浴锅中孵育5分钟即可形成。
【技术特征摘要】
1.一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于以下合成步骤：(1)将0.5μM含有聚AT的dsDNA和1μMcDNA加入到10mM的MOPS缓冲液中(150mMNaCl，pH7.5)。(2)将混合溶液在90℃恒温水浴锅中加热约10分钟，然后缓慢冷却至室温。(3)在杂交产物中混入500μMCuSO4和2mML-抗坏血酸(AA)，继而在25℃水浴锅中孵育5分钟即可形成。2.根据权利要求1所述的一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于：所有的检测实验在10mM的MOPS缓冲液中进行(150mMNaCl，pH7.5)。3.根据权利要求1所述的一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于检测方法为：在最佳优化条件...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡昌群，向灵，龚行，韩云鹏，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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