一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR‑TKI敏感突变的方法。该方法的具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；(3)通过常用EGFR‑TKI灵敏突变检测的方法进行检测。本发明专利技术方法用于检测EGFR突变，结果准确，灵敏度和特异性高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法。
技术介绍
表皮生长因子受体EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR锚定在细胞膜上，并通过络氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)向下传导信号的作用。EGFR在肿瘤的发生中起重要作用，针对EGFR-TK的靶向抑制剂(EGFR-TKinhibitor,EGFR-TKI)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对EGFR-TKI都有反应，只有当EGFR基因18-21外显子发生EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。当肿瘤细胞不携带EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测EGFR-TKI敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。目前检测EGFR-TKI敏感突变的DNA来源主要包括组织DNA和外周血cfDNA等。然而，这些DNA来源样本存在较多不足之处。对于组织DNA来说，虽然可以通过组织活检、或者手术得到较多的组织，并提取到足量的DNA。但是，其缺点也非常明显，对于许多无法获得组织样本的患者而言，就无法获得足量DNA进行检测。另外，由于癌症组织异质性的特点，即使得到癌症组织，也仍然存在较大可能得不到有效的目标DNA。外周血cfDNA虽然可以弥补癌症组织来源DNA的不足，但是由于ctDNA在cfDNA中占比非常少，并且容易受到血液中其他物质的干扰，因此，在实际应用中存在灵敏度和特异性较低的情况。细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)具有磷脂双分子层结构，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等。研究证实，EVs可作为信使，通过血液、尿液、乳汁以及唾液等途径介导细胞间的信号的传导。虽然EVs的形成机理仍然不是特别清楚，但是研究发现，EVs携带各种蛋白、核酸，甚至全基因组的DNA。所以，EVs内容物在一定程度上反映了肿瘤的相关信息，针对肿瘤检测而言是一种潜在的肿瘤分子标志物，并且研究发现，肿瘤组织释放外泌体等EVs的量远高于正常组织。因此，利用EVs所含DNA检测EGFR-TKI敏感突变具有较高实用价值。
技术实现思路
为了克服现有检测DNA样本来源的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法。本专利技术使用EVs中所含有的DNA，进行EGFR-TKI敏感突变检测，其能有效的获得足量的目标DNA，进而对EGFR-TKI进行敏感突变检测，其检测灵敏度和特异性高。本专利技术的技术方案具体介绍如下。一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法，具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；(3)通过常用EGFR-TKI灵敏突变检测的方法进行检测。本专利技术中，步骤(1)中，常规细胞外囊泡EVs提取方法包括超速离心法、PEG沉淀法和成品试剂盒。本专利技术中，步骤(1)中，体液来源包括血液、尿液、胸水、乳汁、胆汁和唾液。本专利技术中，步骤(2)中，表面活性剂细胞为细胞裂解表面活性剂；其选自SDS或TritonX-100中任一种，表面活性剂的浓度为0.1wt％-50wt％。本专利技术中，步骤(2)中，常规DNA提取的方法包括酚氯仿法、磁珠法和成品试剂盒。本专利技术中，步骤(3)中，EGFR-TKI敏感突变检测方法包括PCR、一代测序和二代测序。和现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：EVs中直接携带了母本细胞的遗传物质，这些DNA保存了非常完整的母本细胞的遗传信息，并且其中的DNA长度较长，避免了cfDNA非常短的缺点。另外EVs是由活细胞主动分泌到外周血中的，因此直接反映了患者的实时生理状态，提高了检测的准确性，进而对EGFR-TKI进行敏感突变检测，其检测灵敏度和特异性高。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细介绍。实施例1armsPCR检测非小细胞肺癌患者血液EVs-DNA和cfDNA的EGFR-TKI敏感突变检测，并进行对比，患者信息如表1所示。1、患者静脉取血5ml，30min内2600g离心15min，取上层血浆1ml。2、向1ml血浆中加入等体积15％PEG(w/v)的NaCl(1M)溶液。混合均匀后，4℃静置1h。3、静置后，4℃下3000g离心15min，弃去上清。4、向沉淀中加入200μl1％SDS裂解液，56℃孵育30min。5、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。6、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。7、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。8、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlTE缓冲液，得到EVs-DNA。9、取步骤1中分离的血浆1ml。10、加入1ml2％SDS裂解液，56℃孵育30min。11、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。12、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。13、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。14、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlTE缓冲液，得到cfDNA。15、将提取得到的DNA上样armsPCR进行EGFR-TKI敏感突变检测，如表2所示，跟组织样本金标准对比，EVs的灵敏度为25.7％，cfDNA的灵敏度为14.2％，利用EVs检测的效果较好。armsPCR检测的位点包括19外显子缺失常见的10种突变(E746-A750del(Ⅰ)；E746-T750delI；E746-T751delA；E746-S752delV；E746-A750del(Ⅱ)；L747-T751del；L747-S752del；L747-A750delP；L747-P753delS；L747-T751delP)和21外显子L858R突变，涵盖整个EGFR-TKI敏感突变的90％。PCR反应体系如表3所示，10×buffer配置如表4所示。反应条件为：表1实验患者基本信息表2cfDNA、EVs-DNA检出情况跟组织DNA检出情况对比。表3一份PCR反应液原料加入量10×buffer2.5μl25mMMgCl23μlTaq酶0.25μl模板2μl25mMdNTPs2.5μl上游引物0.25μl下游引物0.25μl探针0.25μlddH2O将总体积补至25μl表410×buffer(总体积1毫升)原料加入量1MTris100μl1MKCl500μlTritonX-10010μlTE390μl实施例2一代测序检测非小细胞肺癌患者血液EVs-DNA和cfDNA的EGFR-TKI敏感突变检测，并进行对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR‑TKI敏感突变的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；(3)通过常用EGFR‑TKI灵敏突变检测的方法进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；(3)通过常用EGFR-TKI灵敏突变检测的方法进行检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，常规细胞外囊泡EVs提取方法包括超速离心法、PEG沉淀法和成品试剂盒。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷豪志，万源，张群，祝琳，
申请(专利权)人：上海浦美医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31