一种富集固定尿路脱落细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种富集固定尿路脱落细胞的方法，具体步骤如下：将培养皿放入充满高纯氧的等离子发生腔中活化表面；将APTES/APTMS/TSD按一定比例混匀后，用乙醇稀释，随后将稀释液加入至培养皿中；将氨水的水溶液加入至上述培养皿中，振荡混匀后，静置；反应结束后，吸除反应液，纯水清洗若干次后，培养皿置于75

【技术实现步骤摘要】
一种富集固定尿路脱落细胞的方法
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][0001]本专利技术属于用于材料和表面科学的纳米
，具体地说是一种富集固定尿路脱落细胞的方法。
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技术介绍
][0002]膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。膀胱癌以膀胱尿路上皮癌最为常见，占90％以上。
[0003]目前，膀胱癌术后随访最常用的方法包括膀胱镜、影像学检查、尿脱落细胞学检查、荧光原位杂交等。其中，膀胱镜发展较为成熟，具有较高的敏感性和特异性，但是其作为一种侵入式、创伤性的检查手段，会增加患者痛苦，不易推广，且禁忌症较多；影像学检查虽然具有无创检测的优势，但对病灶较小的肿瘤敏感性低，且存在较高的假阳性率；尿脱落细胞学检查和荧光原位杂交检测都可通过直接采集尿路脱落细胞进行检测分析，属非侵入式无创检测，特异性高，具有较大的发展空间和推广潜力。然而两者目前都面临敏感性较低的问题。通常情况下，肿瘤细胞在尿路脱落细胞中的占比非常小，所以对于尿路脱落细胞的有效捕获率是提高敏感性的一个关键因素。特别是当病灶较小，脱落的肿瘤细胞稀少时，细胞捕获率对于敏感性的影响呈非线性增长。因此，寻找一种提高对尿路脱落细胞的捕获效率方法用于辅助术后随访是非常必要的。
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技术实现思路
][0004]本专利技术的目的就是要解决上述的不足而提供一种富集固定尿路脱落细胞的方法，具有保持细胞活性及完整性、捕获率高、易于后处理的优点。
[0005]为实现上述目的设计一种富集固定尿路脱落细胞的方法，具体步骤如下：1)培养皿处理：将培养皿放入充满高纯氧的等离子发生腔中活化表面；将APTES、APTMS、TSD三种含氨基硅氧烷按一定比例混匀后，用乙醇稀释；随后将稀释液加入至培养皿中，将氨水的水溶液加入至上述培养皿中，振荡混匀后，静置1
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1.5h；反应结束后，吸除反应液，纯水清洗若干次后，培养皿置于75
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85℃的烘箱中烘干待用；2)样品准备：取100mL尿液离心，以1mL含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿路脱落细胞；3)样品处理：将步骤2)的FPBS重悬的尿路脱落细胞加入到步骤1)中的经过表面改性培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗。
[0006]进一步地，步骤1)中，稀释液中APTES的质量分数wt％为0.05％
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5％。
[0007]进一步地，步骤1)中，稀释液中TSD的质量分数wt％为0.05％
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5％。
[0008]进一步地，步骤1)中，稀释液中APTMS的质量分数wt％为0.05％
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5％。
[0009]进一步地，步骤1)中，等离子发生腔中通入的气体为高纯氧。
[0010]进一步地，步骤1)中，将细胞培养皿置于等离子发生器中，抽取腔内气体通入高纯氧，反应10min，使其表面粘性增加；配制APTES/APTMS/TSD的乙醇溶液，且APTES、APTMS、TSD
的wt％均为0.5％；将1mL APTES/APTMS/TSD的乙醇溶液加入到培养皿中，加入0.5mL 1％氨水溶液，振荡混匀后，放置1h；吸除反应液，用纯水清洗培养皿3
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4次，将培养皿置于80℃烘箱烘干1h。
[0011]进一步地，步骤2)中，尿液标本留取后在2h内及时处理尿液离心，或置于2～8℃冰箱内保存但不超过6h。
[0012]进一步地，步骤3)中，将步骤2)的FPBS重悬的尿路脱落细胞加入步骤1)中的培养皿中，于37℃培养1h；再将培养皿放置4℃10min，缓慢吸出多余液体，加入4％多聚甲醛，4℃放置10min；继续缓慢吸出多余液体，加入PBS进行洗涤。
[0013]本专利技术同现有技术相比，通过使用O2等离子体及APTES/APTMS/TSD对培养容器进行表面改性，获得具有高细胞亲和性的培养容器，然后收集并制备FPBS重悬的尿路脱落细胞，将FPBS重悬的尿路脱落细胞加入经过表面改性培养容器中，贴壁富集并固定，该方法能够用于富集固定尿液中脱落细胞，具有保持细胞活性及完整性、捕获率高、易于后处理的优点，值得推广应用。
[具体实施方式][0014]本专利技术属于B82Y30/00用于材料和表面科学的纳米
，提供了一种富集固定尿路脱落细胞的方法，具体步骤如下：(1)将培养皿放入充满高纯氧的等离子发生腔中活化表面；将APTES/APTMS/TSD按一定比例混匀后，用乙醇稀释，随后将稀释液加入至培养皿中；将氨水的水溶液加入至上述培养皿中，振荡混匀后，静置1
–
1.5h；反应结束后，吸除反应液，纯水清洗若干次后，培养皿置于75
–
85℃的烘箱中烘干待用；(2)取100mL尿液离心，以1mL含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿路脱落细胞；(3)将步骤(2)的FPBS重悬的尿路脱落细胞加入到步骤(1)中的培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗。步骤(1)中，稀释液中APTES、TSD、APTMS的质量分数(wt％)均为0.05％
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5％；等离子发生腔中通入的气体为高纯氧。
[0015]本专利技术中，为尽可能多的收集尿路脱落细胞对培养皿进行特殊表面处理。通过用等离子态的氧气对培养皿表面进行改性，使其表面具有大量羟基官能团(-OH)用于形成Si-O共价键。在合适的催化剂作用下，APTES、APTMS、TSD三种含氨基硅氧烷按一定比例，通过水解缩合形成无定形二氧化硅为主的微纳结构，以Si-O共价键的形式偶联于培养皿的表面。经过修饰后的培养皿表面具有伯胺、仲胺及羟基等多种官能团，通过电荷相互作用及分子间氢键增强细胞与表面皿之间的相互作用让细胞紧密地贴合在培养皿底部，进而可以进行后续处理及分析。
[0016]下面结合具体实施例对本专利技术作以下进一步说明：
[0017]实施例1
[0018]一、处理培养皿
[0019]1.将细胞培养皿置于等离子发生器中，抽取腔内气体通入高纯氧，反应10min，使其表面粘性增加，以便与APTES结合；
[0020][0021]2.配制APTES/APTMS/TSD的乙醇溶液(0.5％/0.5％/0.5％wt％)；
[0022]APTES的结构式如下所示：
[0023][0024]APTMS的结构式如下所示：
[0025][0026]TSD的结构式如下所示：
[0027][0028]3.将1mLAPTES/APTMS/TSD的乙醇溶液加入到培养皿中，加入0.5mL 1％氨水溶液，振荡混匀后，放置1h。
[0029]4.吸除反应液，用纯水清洗培养皿3
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4次；
[0030]5.将培养皿置于80℃烘箱烘干1h。
[0031]二、样品准备
[0032]1.晨尿：早晨5点至6点留尿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集固定尿路脱落细胞的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)培养皿处理：将培养皿放入充满高纯氧的等离子发生腔中活化表面；将APTES、APTMS、TSD三种含氨基硅氧烷按一定比例混匀后，用乙醇稀释；随后将稀释液加入至培养皿中，将氨水的水溶液加入至上述培养皿中，振荡混匀后，静置1
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1.5h；反应结束后，吸除反应液，纯水清洗若干次后，培养皿置于75
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85℃的烘箱中烘干待用；2)样品准备：取100mL尿液离心，以1mL含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿路脱落细胞；3)样品处理：将步骤2)的FPBS重悬的尿路脱落细胞加入到步骤1)中的经过表面改性培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗。2.如权利要求1所述的富集固定尿路脱落细胞的方法，其特征在于：步骤1)中，稀释液中APTES的质量分数wt％为0.05％
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5％。3.如权利要求1所述的富集固定尿路脱落细胞的方法，其特征在于：步骤1)中，稀释液中TSD的质量分数wt％为0.05％
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5％。4.如权利要求1所述的富集固定尿路脱落细胞的方法，其特征在于：步骤1)中，稀释液中APTMS的...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈斌，韩云波，张群，
申请(专利权)人：上海浦美医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：