用于生产活性肝细胞生长因子（HGF）的方法技术

【问题】提供一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子激活物(HGFA)和一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子(HGF)的方法。【解决方案】本发明专利技术涉及一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性HGFA的方法。该方法的特征在于其包括通过在无血清的培养基中对能够表达无活性肝细胞生长因子激活物(前‑HGFA)的哺乳动物细胞进行培养以获得包含前‑HGFA的培养上清液的步骤，和将包含在上述步骤中获得的前‑HGFA的培养上清液调节至弱酸性值以将前‑HGFA转化为活性HGFA的步骤。本发明专利技术还涉及一种使用通过上述方法生产的HGFA来生产活性HGF的方法。

A Method for Producing Active Hepatocyte Growth Factor (HGF)

[Question] Provides a method for producing active hepatocyte growth factor activator (HGFA) without using animal serum and a method for producing active hepatocyte growth factor (HGF) without using animal serum. The invention relates to a method for producing active HGFA without using animal serum. The method is characterized by the steps of obtaining culture supernatant containing pre-HGFA by culturing mammalian cells capable of expressing inactive hepatocyte growth factor activator (pre-HGFA) in serum-free medium and adjusting the culture supernatant containing pre-HGFA obtained in the above steps to a weak acidity value to convert pre-HGFA into active HGFA. Suddenly. The invention also relates to a method for producing active HGF by using HGFA produced by the above method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产活性肝细胞生长因子（HGF）的方法
本专利技术涉及一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子激活物(在本文中也称为“活性HGFA”)和活性肝细胞生长因子(在本文中也称为“活性HGF”)的方法。
技术介绍
HGF是从人类暴发型肝炎患者的血浆中纯化的、具有肝实质细胞增殖活性的因子(专利文献1和非专利文献1)，并且已经被报道具有各种药理学效果，例如抗肿瘤效果、增强细胞介导的免疫、伤口治疗效果和组织再生促进效果(专利文献2)。迄今为止，已经通过重组DNA技术克隆并产生了编码上述HGF的基因(专利文献3-5)。此外，已知HGF呈单链和双链形式，其由2种类型的亚基构成(大约60kDa的α链和大约30kDa的β链)，其中单链形式不具有生物活性并以双链形式获得生物活性。此外，已知在通过重组DNA技术的生产中，HGF可以在用动物血清的培养中作为活性双链形式获得，但是在不用动物血清的培养中，生产的大部分HGF是作为无活性单链形式获得的(例如，专利文献6)。由于动物血清中含有的蛋白酶参与从单链无活性肝细胞生长因子形式(在本文中也称为“前HGF”)到双链活性HGF形式的转化，因此认为有必要使用动物血清以有效获得活性HGF。另一方面，近年来，通过重组DNA技术生产生物材料的主流是在没有动物血清的情况下进行培养以避免病毒污染等风险。因此，为了用无动物血清的培养基生产活性HGF，有必要通过一些手段将单链前-HGF形式转化为活性HGF。已知可以将前-HGF转化为活性HGF的HGFA(专利文献7)、或丝氨酸蛋白酶如尿激酶型纤溶酶原激活物(非专利文献2)是此类手段。然而，存在如下问题：可以将前-HGF转化为活性HGF的这些酶是血清来源的，并且当需要通过将基因整合到微生物或动物细胞中进行生产来生产这些酶时，它们作为前体形式在无血清培养中生产并且因此难以原样使用。引用列表专利文献[专利文献1]日本公开的未经审查的专利申请公开号S63-22526[专利文献2]日本专利号2747979[专利文献3]日本专利号2577091[专利文献4]日本专利号2859577[专利文献5]日本专利号3072628[专利文献6]日本专利号3213985[专利文献7]日本公开的未经审查的专利申请公开号H5-103670非专利文献[非专利文献1]J.Clin.Invest.[临床研究杂志]，81，414(1988)[非专利文献2]JGH[JGH杂志]26(2011)增刊1；188-202，第192页
技术实现思路
专利技术欲解决的问题本专利技术的目的是提供一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性HGFA和活性HGF的方法。本专利技术的另一个目的是提供通过本专利技术的方法生产的活性HGFA、活性HGF及其制剂。解决问题的技术手段作为本专利技术人为解决上述问题而进行的广泛研究的结果，发现通过在无血清的培养基中对表达无活性肝细胞生长因子激活物(前-HGFA)的哺乳动物细胞进行培养以获得其培养上清液，并通过对上述培养上清液进行特定处理，前述培养上清液中含有的前-HGFA可以转化为活性HGFA。因此，由于用动物血清的培养中生产的前-HGF可以通过在不用动物血清的培养中类似地生产的活性HGFA被转化为活性HGF，因此可以生产不含动物血清来源组分的活性HGF或包含其的制剂。因此，本专利技术涵盖以下方面：[1]一种用于生产活性肝细胞生长因子激活物(HGFA)的方法，该方法的特征在于其包括：步骤1：通过在无血清的培养基中对表达无活性肝细胞生长因子激活物(前-HGFA)的哺乳动物细胞进行培养来获得包含前-HGFA的培养上清液的步骤，和步骤2：将包含在上述步骤中获得的前-HGFA的该培养上清液调节至弱酸性以将前-HGFA转化为活性HGFA的步骤。[2]根据[1]所述的生产方法，其特征在于所述步骤进一步包括向所述培养上清液中添加硫酸化多糖。[3]根据[1]或[2]所述的生产方法，其特征在于将该培养上清液调节至弱酸性的所述步骤是将pH调节至4.0-6.0的步骤。[4]根据[1]至[3]中任一项所述的生产方法，其特征在于所述将该培养上清液调节至弱酸性的所述步骤在是15℃-40℃的温度进行。[5]根据[1]至[4]中任一项所述的生产方法，其特征在于所述培养上清液是在培养物中的哺乳动物细胞的存活率下降后获得的。[6]根据[1]至[5]中任一项所述的生产方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。[7]根据[1]至[6]中任一项所述的生产方法，其特征在于所述前-HGFA具有SEQIDNO.2中所示的氨基酸序列。[8]根据[1]至[7]中任一项所述的生产方法，其特征在于所述培养上清液是所述培养上清液本身、所述培养上清液的稀释液、所述培养上清液的浓缩物或所述培养上清液的部分纯化的产物。[9]活性HGFA，该活性HGFA的特征在于其是通过根据[1]至[8]中任一项所述的生产方法获得的。[10]一种用于生产活性肝细胞生长因子(HGF)的方法，该方法的特征在于其包括允许活性HGFA作用于包含无活性肝细胞生长因子(前-HGF)的培养上清液以将所述前-HGF转化为活性HGF的步骤，其中包含前-HGF的所述培养上清液是通过在无血清的培养基中对表达前-HGF的细胞进行培养而获得的培养上清液，并且所述活性HGFA是通过根据[1]至[8]中任一项所述的方法生产的。[11]根据[10]所述的生产方法，其特征在于用于培养表达前-HGF的细胞的所述培养基是不含任何动物来源组分的培养基。[12]根据[10]或[11]所述的生产方法，其特征在于所述前-HGF具有SEQIDNO.1中所示的氨基酸序列。[13]活性HGF，该活性HGF的特征在于其是通过根据[10]至[12]中任一项所述的生产方法获得的。本领域技术人员应认识到，上述的本专利技术的一个或多个特征的任何组合的专利技术也涵盖于本专利技术的范围内。专利技术效果根据本专利技术，提供了一种用于不使用动物血清的情况下生产活性HGFA和活性HGF的方法。在本专利技术的用于生产活性HGF的方法中，由于在其生产方法中不需要使用任何动物血清，包含通过上述生产方法获得的活性HGF的组合物不包含动物血清来源组分并且可以非常安全地应用于人类。附图说明图1示出了通过激活前-HGFA培养上清液所制备的HGFA培养上清液激活了源自包含前-HGF的CHO细胞的培养上清液中的前-HGF。图2示出了关于前-HGFA培养上清液被激活的条件的采用实验设计(DoE)的验证结果。图3示出了色谱纯化后的SDS-PAGE，所述色谱纯化采用多峰阴离子交换剂CaptoAdhere作为色谱载体并采用包含0.25M精氨酸和0.7M精氨酸的20mMTris-盐酸盐缓冲液(pH8.0)作为洗脱液。图4示出了色谱纯化后的SDS-PAGE，所述色谱纯化采用多峰阴离子交换剂CaptoAdhere作为色谱载体并采用包含1M精氨酸的20mMTris-盐酸盐缓冲液(pH8.0)作为洗脱液。图5示出了纯化的产物在每个纯化阶段的非还原性和还原性SDS-PAGE结果，其中用包含未被HGFA培养上清液激活的前-HGF的培养上清液进行与实例5类似的纯化。图6示出了测量在TGFβ的存在下，对实例5中获得的纯化的HGF的细胞增殖活性的结果。具体实施方式除非另有明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产活性肝细胞生长因子激活物(HGFA)的方法，该方法的特征在于其包括：步骤1：通过在无血清的培养基中对表达无活性肝细胞生长因子激活物(前‑HGFA)的哺乳动物细胞进行培养来获得包含前‑HGFA的培养上清液的步骤，和步骤2：将包含在上述步骤中获得的前‑HGFA的该培养上清液调节至弱酸性以将前‑HGFA转化为活性HGFA的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.17 JP 2016-0541281.一种用于生产活性肝细胞生长因子激活物(HGFA)的方法，该方法的特征在于其包括：步骤1：通过在无血清的培养基中对表达无活性肝细胞生长因子激活物(前-HGFA)的哺乳动物细胞进行培养来获得包含前-HGFA的培养上清液的步骤，和步骤2：将包含在上述步骤中获得的前-HGFA的该培养上清液调节至弱酸性以将前-HGFA转化为活性HGFA的步骤。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述步骤进一步包括向所述培养上清液中添加硫酸化多糖。3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于将该培养上清液调节至弱酸性的所述步骤是将pH调节至4.0-6.0的步骤。4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产方法，其特征在于将该培养上清液调节至弱酸性的所述步骤是在15℃-40℃的温度进行。5.根据权利要求1至4中任一项所述的生产方法，其特征在于所述培养上清液是在培养物中的哺乳动物细胞的存活率下降后获得的。6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。7.根据权利要求1至6中任一项所述的生...

【专利技术属性】
技术研发人员：清水正史，佐藤俊孝，有田贵久，
申请(专利权)人：卫材RD管理有限公司，
类型：发明
国别省市：日本,JP