对糖基化PD-L1特异的双重功能抗体及其使用方法技术

提供了相对于未糖基化的PD‑L1而特异性地与糖基化PD‑L1结合，阻断PD‑L1与PD‑1的结合并促进PD‑L1的内化和降解的抗体。提供了识别糖基化PD‑L1蛋白上的特定表位并且表现出阻断PD‑L1与PD‑1结合以及还促进细胞上的PD‑L1内化的双重功能的抗体。在一些方面，还提供了在PD‑L1细胞外结构域的氨基和羧基末端位置包含糖基化氨基酸残基的PD‑L1多肽。还提供了使用此类抗体治疗癌症，特别是PD‑L1阳性癌症的方法。

Specific dual-function antibody against glycosylated PD-L1 and its application

Antibodies that specifically bind to glycosylated PD_L1 relative to non-glycosylated PD_L1 were provided to block the binding of PD_L1 to PD_1 and promote the internalization and degradation of PD_L1. Specific epitopes on glycosylated PD L1 protein were identified and double-functional antibodies were provided to block the binding of PD L1 to PD 1 and promote the internalization of PD L1 in cells. In some respects, PD L1 polypeptide containing glycosylated amino acid residues at the amino and carboxyl end of the extracellular domain of PD L1 is also provided. The use of such antibodies in the treatment of cancers, especially those with PD_L1 positive, is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对糖基化PD-L1特异的双重功能抗体及其使用方法序列表本申请包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，其由此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝(于2017年3月23日创健的)被命名为24258_105007_SL.txt，大小为40,452字节。相关领域本公开总体上涉及分子生物学、医学和肿瘤学领域。更特别地，提供了特异性地结合糖基化PD-L1的新抗体以及其用于治疗癌症的用途。背景T细胞活化的持续性已经彻底改变了对广谱恶性癌症的治疗。例如，伊匹木单抗(FDA批准的第一个靶向T细胞反应的检查点阻断)的开发使得治疗转移性黑色素瘤成为可能(Hodi,F.S.等，2010,NEJM,363:711-723；Robert,C.等，2013,Clin.CancerRes.,19:2232-2239；andRobert,C.等，2011,NEJM,364:2517-2526)。虽然抗细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)单克隆抗体在治疗黑素瘤患者方面显示出有希望的结果，但靶向PD-1和PD-L1的第二代检查点抑制剂在III期临床试验中表现出更好的临床活性和安全性(Topalian,S.L.等，2012,NEJM,366:2443-54和Brahmer,J.R.等，2012,NEJM,366:2455-2465)。因为PD-L1还具有诱导癌细胞进展的致癌潜力(Topalian,S.L.等，Id.；Page,D.B.等，2014,Ann.Rev.Med.,65:185-202)。除了其免疫抑制活性以外，靶向PD-1/PD-L1相互作用通过阻断经由PD-1的免疫抑制同时减少经由PD-L1的细胞进展而提供双重功效，并且预期具有更敏感的结果(Topalian,S.L.等，同上；Brahmer,J.R.等，同上；和Hamid,O.,2013,NEJM,369:134-144)。2014年，美国正在进行10多项临床试验，测试抗PD-L1和/或抗PD-1抗体作为单一药剂或联合使用的效力(Page,D.B.等，同上)。美国FDA批准了两种用于治疗某些癌症的抗PD-1治疗性抗体(派姆单抗(pembrolizumab))和(尼沃鲁单抗(nivolumab))。然而，PD-L1的病理生理功能和调节机制仍未完全确定。重新唤醒沉默的免疫反应，特别是效应T细胞，最近被添加到治疗选项的所有库中，其中治疗选项包括手术切除、化学疗法、放射疗法和靶向疗法。虽然使用抗CTLA-4单克隆抗体时(Dunn，GP等，2002,Nat.Immunol.,3:991-998；andLeach,D.R.等，1996,Science,271:1734-1736)最初证明在治疗转移性黑色素瘤方面取得了成功，但已经显示其也诱导自身免疫反应。与仅影响免疫细胞的抗-CTLA-4抗体不同，抗PD-L1抗体和抗PD-1抗体在细胞水平和肿瘤部位起作用以阻断表达PD-1的效应T细胞与表达PD-L1的肿瘤细胞之间的相互作用。这产生了来自肿瘤细胞和T细胞的双重影响，从而限制了副作用并提供了更好的治疗功效(Okazaki，T.等，2013,Natureimmunology,14:1212-1218)。需要更好地理解PD-L1介导的免疫抑制和对肿瘤细胞的促致癌作用的病理生理机制，以开发针对该途径的更强效的治疗剂。仍然需要成功地靶向PD-1/PD-L1途径并激活免疫系统的效应细胞以攻击肿瘤细胞并治疗癌症的新的和更有效的治疗剂和方法。概述本专利技术人已发现，在肿瘤细胞上表达的PD-L1(也称为CD274、PDCD1L1或B7-H1)的糖基化促进或增强与免疫效应细胞诸如T细胞上表达的PD-1的结合，从而增强对T细胞抗肿瘤细胞的活性的抑制。本专利技术人还发现PD-L1的糖基化也可以稳定PD-L1在细胞表面上的表达，从而减少PD-L1的内化率和细胞内降解。本专利技术人已鉴定了相对于未糖基化的人ICP多肽而言优先与糖基化人PD-L1多肽结合的抗体。如本文中所用，此类优先结合糖基化人PD-L1的抗体被称为“抗glycPD-L1抗体”。如本文所述的抗glycPD-L1抗体还具有双重功能，因为它们阻断PD-L1/PD-1相互作用并且还促进表达PD-L1的细胞上PD-L1的内化和细胞内降解；因此，这些抗体被称为“双功能”抗体。因此，提供了表现出抑制PD-1/PD-L1结合和促进PD-L1内化和降解的双重功能的此类抗glycPD-L1抗体。还提供了通过施用一种或多种抗glycPD-L1抗体在有此需要的受试者中治疗癌症，特别是其细胞表达或过表达PD-L1的癌症的方法。如本文所述的抗glycPD-L1抗体抑制或阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用，并且还降低肿瘤细胞上的PD-L1水平，从而抑制由PD-1/PD-L1相互作用引起的免疫抑制，并促进表达PD-1的效应T细胞对表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞毒活性的持续存在。通过抑制PD-1/PD-L1相互作用并降低肿瘤细胞表面上糖基化PD-L1的水平，所述抗glycPD-L1抗体可增强效应T细胞反应并介导抗肿瘤活性。如本文中所用，术语肿瘤和癌症可互换使用。除非另有说明，否则本文所用的“PD-L1”是指PD-L1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-L1(其氨基酸序列是SEQIDNO:1)；“PD-1”是指PD-1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-1。本专利技术人还发现人PD-L1在人PD-L1蛋白(例如，如SEQIDNO:1所示)的氨基酸位置N35、N192、N200和/或N219处的细胞外结构域中的四个位点处被糖基化。所述抗glycPD-L1抗体可以与这些位点中的一个或多个结合，例如，可以不与在这些糖基化位点中的一个或多个位点处具有突变(例如，糖基化共有序列中的谷氨酰胺对天冬酰胺的取代)，因而在这些一个或多个位点处未被糖基化的PD-L1结合。因此，在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体特异性地与PD-L1糖肽或其肽中的一个或多个糖基化基序结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与包含糖基化基序和相邻肽的PD-L1糖肽结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与在三维上位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列结合。因此，在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体识别并选择性地结合糖基化的PD-L1的构象表位。举例来说，在某些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1结合的Kd相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％，但在一些实施方案中，不超过相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的5％、10％、15％、20％或25％，但仍然表现出双重抗糖基化PD-L1功能。应理解，涵盖在前述Kd值之间的值以及等于前述Kd值的值。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半，但仍表现出双重抗糖基化PD-L1功能。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd至多为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的1/5。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的抗体，相对于未糖基化的PD‑L1，所述抗体选择性与糖基化PD‑L1结合，抑制糖基化PD‑L1与PD‑1的结合，并促进肿瘤细胞上的PD‑L1内化和降解。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.29 US 62/314,652;2016.07.12 US 62/361,3121.一种分离的抗体，相对于未糖基化的PD-L1，所述抗体选择性与糖基化PD-L1结合，抑制糖基化PD-L1与PD-1的结合，并促进肿瘤细胞上的PD-L1内化和降解。2.权利要求1的分离的抗体，其为重组工程化的、嵌合的或人源化的。3.权利要求1或权利要求2的分离的抗体，其与糖基化PD-L1结合的Kd小于由所述抗体与未糖基化的PD-L1结合所展示的Kd的一半。4.权利要求3的分离的抗体，其与糖基化PD-L1结合的Kd为由所述抗体与未糖基化的PD-L1结合所展示的Kd的至多1/10。5.权利要求4的分离的抗体，其以5-20nM的亲和力结合糖基化PD-L1。6.权利要求1至3中任一项的分离的抗体，其中可通过荧光标记直接或间接检测的所述抗体，优先与表达糖基化PD-L1的细胞结合，其中在细胞流式细胞术测定中，其测量的荧光强度(MFI)为由所述抗体与表达未糖基化的PD-L1的细胞结合所展示的MFI的2倍至10倍。7.权利要求6的分离的抗体，其中所述抗体优先与表达糖基化PD-L1的细胞结合的MFI为由所述抗体与表达未糖基化的PD-L1的细胞结合所展示的MFI的3倍至5倍或更多。8.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其特异性地与糖基化PD-L1的表位结合，所述表位包含SEQIDNO:1的氨基酸H69、S80、Y81、Y112、R113、K162、K124和S169中的至少一个。9.权利要求8的分离的抗体，其中所述表位包含SEQIDNO:1的区域V68至V128内或区域L74至Q173内的氨基酸。10.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其特异性地与糖基化PD-L1的表位结合，所述表位包含SEQIDNO:1的氨基酸Y112、R113和S117中的至少一个。11.权利要求10的分离的抗体，其中所述表位包含SEQIDNO:1的区域D108至V128内的氨基酸。12.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其特异性结合由单克隆抗体(MAb)STM073或MAbSTM108识别的PD-L1的表位。13.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其与MAbSTM073或MAbSTM108竞争或交叉竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。14.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其包含MAbSTM073或MAbSTM108的重链可变(VH)结构域或轻链可变(VL)结构域。15.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其包含来自MAbSTM073或MAbSTM108的重链CDR1-3和/或轻链CDR1-3。16.权利要求15的分离的抗体，其具有人抗体框架区。17.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的抗体，其中所述重链可变结构域(VH)具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:19的氨基酸序列。18.权利要求1至7或17中任一项的分离的抗体，其中VL结构域具有SEQIDNO:11或SEQIDNO:27的氨基酸序列。19.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其中所述VH结构域具有SEQIDNO:3的氨基酸序列，并且所述VL具有SEQIDNO:11的氨基酸序列。20.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其中所述VH结构域具有SEQIDNO:19的氨基酸序列，并且所述VL结构域具有SEQIDNO:27的氨基酸序列。21.权利要求17-20中任一项的分离的抗体，其包含人恒定结构域。22.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其具有包含具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDRH3的VH结构域，或包含具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的CDRH3的VH结构域。23.权利要求1至7或22中任一项的分离的抗体，其具有包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的CDRL3的VL结构域。24.权利要求1至7中任一项的分离的抗体，其具有包含具有SEQIDNO:20的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的CDRH3的VH结构域，或包含具有SEQIDNO:21的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQIDNO:23的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的CDRH3的VH结构域。25.权利要求1至7或23中任一项的分离的抗体，其具有包含具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQIDNO:30的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的CDRL3的VL结构域。26.权利要求1至7的分离的抗体，其包含由与SEQIDNO:2或18的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码的VH结构域，和/或由与SEQIDNO:19...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·S·刘，E·M·钟，YS·金，韩奎利，朴炯辰，MC·洪，CW·李，SO·林，
申请(专利权)人：斯特库比股份有限公司，得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：韩国,KR