本发明专利技术涉及抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用。该抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3之一。该抗体可用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物；该核酸用于制备抗GPC3全人源化抗体、药物或药物组合物；该细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物；该药物或药物组合物具有针对GPC3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。本发明专利技术通过噬菌体展示技术筛选出抗GPC3的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高；采用该抗体的细胞如嵌合抗原受体T细胞对GPC3阳性的肿瘤具有有效地杀伤作用。
【技术实现步骤摘要】
抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用
本专利技术涉及一种抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用，属于生物
技术介绍
据专利技术人所知，肝细胞癌发病广，致死率高，缺乏有效的治疗手段。病人晚期存活率仅有3％[1]。多数病人确诊时已经处于癌变晚期，对化疗药物不敏感，手术切除后复发率高[2,3]。glypican-3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通过GPI锚定在细胞膜表面。GPC3在胚胎发育早期表达，通过调控发育过程中的关键信号通路(如Wnt信号)参与调控细胞增殖。在个体发育成熟后，GPC3表达关闭。大量的研究发现，GPC3在肝细胞癌中特异性高表达，是目前较受关注的肝细胞癌诊断标志物和治疗靶点[4,5]。由于肝脏的器官功能特殊性，小分子化学药物极易被肝脏代谢清除。相比较而言，生物大分子药物如治疗型抗体在肝癌的治疗中具有高活性、特异性好等优势。由于GPC3是细胞膜表面蛋白，靶向GPC3的抗体除应用于裸抗治疗外，抗体衍生物以及衍生的嵌合抗原受体T细胞均可作为治疗肝细胞癌的可行性手段，具有直接的临床转化潜力。经检索发现，专利号CN201280029201.3，授权公告号CN103596985B的中国专利技术专利，公开了一种对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途。以该技术方案为代表的现有技术中已经存在了一些抗GPC3抗体。专利技术人课题组经系统地试验研究后得出了不同于现有技术的抗GPC3全人源化抗体。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种抗GPC3全人源化抗体、以及具有该抗体的嵌合抗原受体细胞，有抗肿瘤应用前景。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：一种抗GPC3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；iv、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；v、所述轻链包括轻链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；vi、所述轻链包括轻链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。优选地，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述抗体为VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。优选地，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。本专利技术还提供：编码前文所述抗GPC3全人源化抗体的核酸。优选地，所述核酸的序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供：具有前文所述抗GPC3全人源化抗体的细胞或偶联物。优选地，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及抗GPC3全人源化抗体-化疗药物偶联物。本专利技术还提供：前文所述抗GPC3全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。前文所述核酸用于制备抗GPC3全人源化抗体、药物或药物组合物的用途。前文所述细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物的用途。其中，所述药物或药物组合物具有针对GPC3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。本专利技术通过噬菌体展示技术筛选出抗GPC3的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高；具有该抗体的细胞如嵌合抗原受体T细胞对GPC3阳性的肿瘤具有有效地杀伤作用。附图说明图1为实施例1中ELISA检测富集噬菌体对抗原蛋白结合的示意图。图2为实施例1中ELISA检测噬菌体单克隆对抗原结合的示意图。图3为实施例2中SDS-PAGE检测结果图。图4为实施例3中抗体32A9对GPC3蛋白的特异性结合ELISA检测结果图。图5为实施例3中抗体32A9对GPC3阳性细胞的特异性结合FACS检测结果图。图6为实施例4中亲和力分析结果图。图7为实施例5中构建的两个CAR分子的结构图。图8为实施例5中慢病毒感染获得两个CAR-T细胞的流式细胞术检测结果图。图9为实施例6中32A9CAR-T细胞的激活情况结果图。图10为实施例6中32A9CAR-T细胞特异性杀伤A431-GPC3细胞的结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。但是本专利技术不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。实施例1、筛选抗GPC3全人源化抗体采用噬菌体展示技术，以人源GPC3(Q25-S550)蛋白为GPC3抗原进行筛选。其中，该GPC3抗原的制备过程如下：构建pFUSE-hGPC3(Q25-S550)-Fc真核细胞表达载体；该表达载体利用IL-2的信号肽序列置换了GPC3的信号肽序列，引导GPC3-Fc融合蛋白分泌到培养基中；利用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将上述表达载体转染HEK293T细胞，收集上清，并通过ProteinAArgrose(GEHealthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化GPC3-Fc融合蛋白，所得即GPC3抗原。噬菌体展示的具体过程为：以10μg/ml的上文所得GPC3抗原于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；TomlinsonI&J噬菌体文库(GenserviceLtd.,Cambridge,UK，文库大小为1.47x108)以1012pfu与5％脱脂奶粉PBS溶液1:1混合后室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板20次；100μlpH2.0洗脱缓冲液室温洗脱30分钟；向洗脱的噬菌体中加入30μlpH8.0溶液进行中和；将中和后噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增和回收后用于下一轮淘选。淘选后ELISA分析阳性噬菌体富集情况。ELISA检测：以5μg/ml上文所得GPC3抗原、阴性对照蛋白Frizzled-Fc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗GPC3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26‑33；ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50‑59；iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98‑102；iv、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161‑165；v、所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182‑185；vi、所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223‑228。
【技术特征摘要】
1.一种抗GPC3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；iv、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；v、所述轻链包括轻链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；vi、所述轻链包括轻链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。2.根据权利要求1所述的抗GPC3全人源化抗体，其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQIDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。3.根据权利要求1所述的抗GPC...
【专利技术属性】
技术研发人员：高威，刘晓宇，魏丽雯，苟黎明，李娜，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。