硫酸肝素与FK506共轭物酶化学合成以及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种医药化工技术领域的硫酸肝素与FK506共轭物酶化学合成以及应用；提供了一种研究硫酸肝素调控胚胎发育作用机制与理解细胞核中硫酸肝素的构效关系小分子工具或探针，其中所述的硫酸肝素指结构确定且多样化的己糖醛酸与氨基葡萄糖重复二糖单元，同位素

Enzymatic synthesis and application of conjugates of heparin sulfate and FK506

The invention discloses the enzymatic synthesis and application of heparin sulfate and FK506 conjugates in the field of pharmaceutical and chemical technology, and provides a small molecular tool or probe for studying the mechanism of heparin sulfate regulating embryonic development and understanding the structure-activity relationship of heparin sulfate in nucleus. Unit, Isotope

【技术实现步骤摘要】
硫酸肝素与FK506共轭物酶化学合成以及应用
本专利技术属于医药化工
，具体涉及一种硫酸肝素与FK506共轭物酶化学合成以及应用。
技术介绍
硫酸肝素(Heparansulfate,HS)是线性黏多糖，由己糖醛酸与氨基葡萄糖重复二糖结构组成，之间由α-1,4-糖苷键，具有抗凝血、抗病毒、抗炎、抗肿瘤作用以及调控胚胎发育，尤其其调控胚胎发育作用引人注意。干细胞包括肿瘤干细胞中培养中，硫酸肝素的高度硫酸化形式-肝素是干细胞生长必需外源性的物质，不加或缺乏时，生长受阻，提示核内硫酸肝素调控胚胎发育的重要性。细胞核中的硫酸肝素存在与否，直接改变许多细胞生长速率，细胞核内硫酸肝素对细胞行为的调控越来越引起科学家高度关注。随着高分辨成像和高亲和力抗体等分子技术的发展，发现细胞核中硫酸肝素存在比我们想象中更普遍，而且细胞核中硫酸肝素结构与其它细胞器中的硫酸结构差异明显，进一步强调核内硫酸肝素生物作用机制与构效关系的重要性。硫酸肝素是内源性功能生物高分子，由内质网启动生物合成，经高尔基体延长加工成不同长度与硫酸化程度硫酸肝素，最后再由不同的载体转运到靶部位发挥生物功能，然而，由于硫酸肝素水溶性极大，如何被转运到细胞核中以及硫酸肝素中决定转运功能强弱的结构片段都不清楚等等问题，严重制约理解核内生物作用机制和构效关系的厘清(核内硫酸肝素及其细胞功能的控制，基质生物，2014，35，56-59)。因此，外源性硫酸肝素稳定有序安全地穿膜入核是研究核内硫酸肝素生物功能新的解决方法之一。经对现有技术的文献检索发现，临床上免疫抑制剂FK506(tacrolimus)是一种大环内酯,常用来预防器官(包括肝脏、肾脏、心脏及胰)移植后的同种移植排斥反应，具有高特异靶向FKP12、脂溶性强、生物兼容性好以及代谢稳定等特性(合成配体控制信号转导，科学，1993,262，1019-1024.)，能充当体内运输载体，但容易引起免疫抑制副作用。FK506的环外丙烯基中双键是产生免疫抑制效应功能结构片段，破坏烯丙基双键消除FK506免疫抑制活性(通过免疫亲和素-配体复合物的T细胞信号抑制与钙调酶活性丧失有关，生物化学，1992，31,3896-3901.)，但目前并没有报道利用FK506携带硫酸肝素穿膜，更没有利用FK506的环外双键作为连接位点共轭硫酸肝素，引导其穿膜入核。本专利技术以FK506为载体，与不同结构的硫酸肝素共轭，将外源性硫酸肝素携带入核，是研究核内硫酸肝素调控细胞生物功能以及构效关系的比较方便方法，目前为止未见报道。但是，由于硫酸肝素来源困难，天然提取分离往往是混合物，化学合成的硫酸肝素步骤多、产率低，本专利技术采用酶化学方法制备各种结构确定的硫酸肝素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种硫酸肝素与FK506共轭物酶化学合成以及应用；具体是一种通过具有靶向特异性FKP12的免疫抑制剂药物FK506共轭酶化学制备所得不同结构的硫酸肝素，应用于核内硫酸肝素生物功能以及构效关系研究。本专利技术所述的共轭物设计独特，所述的合成反应条件温和，反应试剂易得，所述共轭物可携带硫酸肝素穿膜入核，可作为核内硫酸肝素生物功能与构效关系研究的工具小分子或探针。本专利技术涉及的硫酸肝素-FK506共轭物，是结构式I所代表的化合物，其中，R2、R3、R4为氢或磺酰基(SO3-)，R1为氢、乙酰基(Ac-)或磺酰基(SO3-)，n为1～6，Y为不同芳香烃或3～10碳饱和或非饱和的脂肪烃，或芳香烃与饱和或不饱和脂肪烃共价交替链接，X为氧原子(-O-)或硫原子(-S-)或酰胺键(-CONH2-)或酯键(-COO-)，这些化合物可用于探索核内硫酸肝素的作用机制以及构效关系研究或者治疗因核内硫酸肝素异常引发的疾病。具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案实现：第一方面，本专利技术涉及硫酸肝素-FK506共轭物，其结构式如式I所示：I，其中，R2、R3、R4为氢或磺酰基(SO3-)，R1为氢、乙酰基(Ac-)或磺酰基(SO3-)，n为1～6；Y为芳香烃、C3～10的饱和或非饱和的脂肪烃、芳香烃与C3～10饱和或不饱和脂肪烃的共价交替链接形成的基团，X为氧原子(-O-)、硫原子(-S-)、酰胺键(-CONH2-)或酯键(-COO-)。优选的，所述芳香烃包括苯环或杂芳环。所述杂芳环包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、吲哚或嘌呤。优选的，所述C3～10的饱和的脂肪烃为其中，m为3～10，R5为H、-CH3或-CH2CH3；C3-10非饱和的脂肪烃为其中，I为3～10，R6、R7、R8分别选自H、-CH3、-CH2CH3。第二方面，本专利技术一种硫酸肝素-FK506共轭物的酶化学合成方法，以对硝基苯基β-D-葡萄糖醛酸苷为起始原料，在硫酸肝素生物合成用系列重组酶的作用下，合成硫酸肝素经催化氢化苯环上硝基成氨基，再与环外双键活化的F506发生共轭得结构式I所代表的化合物。优选的，所述硫酸肝素生物合成用系列重组酶选自pmSH2,KfiA,NST,NDSTC5-Epi,2-OST,6-OST,3-OST。优选的，所述合成方法，具体包括如下步骤：S1、在30℃～37℃下，以对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷为起始原料，在HS聚合酶Heparosansynthase-2fromPasteurellamultocida(pmSH2)或KfiA催化下，与UDP-活化乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)或UDP-活化三氟乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNTFA)、UDP-活化葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)交替反应延长至戊糖；再按目标结构的要求，经N-磺酰基转移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferase,NDST)、2-O-磺酰转移酶(2-O-sulfotransferase,2-OST)、C5-异构酶(C5-epimerase,C5-Epi)、6-O-磺酰转移酶(6-O-sulfotransferase,6-OST)、3-O-磺酰转移酶(6-O-sulfotransferase,3-OST)中的一种或几种催化，制备得到重复二糖单位硫酸肝素S2、在氢气保护下，将所述重复二糖单位硫酸肝素溶入水中，用10％Pd/C催化氢化，常温下搅拌半小时，得到含芳香胺硫酸肝素S3、在氮气保护下，以无水四氢呋喃为溶剂，特异性活化FK506的环外双键后与不同长度活化的连接子(Linker)反应得含有链接子的FK506衍生物S4、在氮气保护下，将所述含芳香胺硫酸肝素与含有链接子的FK506衍生物混溶于1,4-二氧六环与20μM-150μM醋酸钠缓冲液中，常温下充分搅拌3～5小时，得所述硫酸肝素-FK506共轭物。优选的，步骤S2中，所述催化氢化采用的氢源选自氢气、甲酸铵中的一种或几种。优选的，步骤S3中，特异性活化FK506的环外双键后与连接子的反应包括如下步骤：A1、以无水二氯甲烷为溶剂，FK506与化合物和苯偶酰二甲基缩酮物质的量1:1.05～1.2:0.01～0.02进行反应，生成化合物6A2、以无水二氯甲烷为溶剂，所述化合物6与Y-H和二环己基二亚胺按物质的量比为1:1.05-1.2:1.1-2混合反应，生成所述含有链接子的FK506衍生物。优选的，步骤S4中，所述醋酸钠缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硫酸肝素‑FK506共轭物，其结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种硫酸肝素-FK506共轭物，其结构式如式I所示：I，其中，R2、R3、R4为氢或磺酰基，R1为氢、乙酰基或磺酰基，n为1～6；Y为芳香烃、C3～10的饱和或非饱和的脂肪烃、芳香烃与C3～10饱和或不饱和脂肪烃的共价交替链接形成的基团，X为氧原子、硫原子、酰胺键或酯键。2.根据权利要求1所述的硫酸肝素-FK506共轭物，其特征在于，所述芳香烃包括苯环或杂芳环。3.根据权利要求1所述的硫酸肝素-FK506共轭物，其特征在于，所述C3～10的饱和的脂肪烃为其中，m为3～10，R5为H、-CH3或-CH2CH3；C3-10非饱和的脂肪烃为其中，I为3～10，R6、R7、R8分别选自H、-CH3、-CH2CH3。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的硫酸肝素-FK506共轭物的酶化学合成方法，其特征在于，以对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷为起始原料，在硫酸肝素生物合成用系列重组酶的作用下，合成硫酸肝素经Pd/C催化氢化苯环上硝基为氨基得含芳香胺硫酸肝素，再与环外双键活化的F506发生反应制备得到所述硫酸肝素-FK506共轭物。5.根据权利要求4所述的硫酸肝素-FK506共轭物的酶化学合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、在30℃～37℃下，以对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷为起始原料，在HS聚合酶pmSH2或KfiA催化下，与UDP-活化乙酰氨基葡萄糖或UDP-活化三氟乙酰氨基葡萄糖、UDP-活化葡萄糖醛酸交替反应延长至戊糖；再按目标结构的要求，经N-磺酰基转移酶、2-O-磺酰转移酶、C5-异构酶、6-O-磺酰转移酶、3-O-磺酰转移酶中的一种或几种催化，制备得到重复二糖单位硫酸肝素S2、在氢气保护下，将所述重复二糖单位硫酸肝素...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31