一种RNA核酸类定值质控物及其制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种靶值定值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好，具有较高使用价值的RNA核酸类定值质控物，以满足科研、临床使用。本发明专利技术由临床阳性血浆(血清)样本或病毒培养物和RNA保护剂稀释液组成，以国际标准物质为溯源，确定其靶值，并利用市场上应用广泛、试剂性能优良的3～5家不同厂家的核酸定量检测试剂盒进行检测。本发明专利技术的能有效的监控临床检验中试剂和仪器的状态以及人员操作；可以在(‑20±5)℃环境中保存一年以上，2～8℃保存，可稳定3个月以上；具有测值稳定，均匀性好，定值准确，可溯源性，与临床样本的互通性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA核酸类定值质控物及其制备方法所属领域本专利技术涉及医学检验
，属于聚合酶链式反应(PCR)
核糖核酸(RNA)类生物制品范畴，具体涉及一种传染类病毒RNA类核酸定值质控物及其制备方法。专利技术背景以荧光定量PCR技术为代表的核酸扩增技术以其高灵敏度、强特异性在医学个分子诊断领域得到广泛应用。然而，出于没有建立生物核酸相应的生物含量、活性和特性测定的计量标准和溯源体系，各生产单位采用不同的标准品、对照品、试剂等进行产品的生产、研发和检测，使得这些产品的测定、评价结果没有计量特性，难以保证检测结果准确、有效；使得不同的实验室使用NAT检测时，在量值、灵敏度和特异性方面差异很大。为减少检测的差异，并使不同实验室、不同方法检测的结果具有可比性，用于NAT的定值质控物是实现体外诊断数据和结果准确一致、生物制品标准化及实验室质量控制的重要工具。目前，英国国家生物制品检定所作为WHO指定的国际标准品实验室，是目前全世界最主要的国际标准品和参考品生产者和分发者，生产超过95％的国际标准品。而我国的质控物数量虽然较多，但品种不全、门类欠缺、结构不合理。品种主要集中在钢铁、地矿和建材等领域，在生物工程、食品成分、临床化学以及新材料、新能源等一些重要发展领域内的质控物则相对比较缺乏。相关质控物的研制相对滞后，使得不少产品的检测无法实现，不得不靠国外进口来满足实验室检测要求。由于这些进口质控物的生产者执行的管理体系不同，量值准确性和溯源性也不同，难以确保我国测量结果的有效性和一致性。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂质控物的需求和依赖也越来越强烈。因此，加强体外诊断试剂质控物建设，不仅有利于诊断结果的准确一致，使各医院的检测结果具有可比性，而且也是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。研制一经济而质量稳定、量值可靠的质控物，其稳定性考察是必不可少的过程，也是研制质控物的重要环节，也是本专利技术的重要部分。总之，为确保质控物有良好的稳定性，所考查及评价的稳定性能真正反映出该质控物稳定性能，使质控物能在有效期内发挥其作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供具有较高的使用价值的RNA类核酸定值质控物，具体品种包括：人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)RNA，丙型肝炎病毒(HCV)RNA，风疹病毒(RV)RNA，肠道病毒71型(EV71)RNA，柯萨奇病毒A16(CA16)RNA，乙型流感病毒(IVB)RNA，甲型流感病毒(IVA)RNA，副流感病毒(PIV)RNA，A组轮状病毒(RTA)RNA。本专利技术的质控物具有靶值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好的特点。为实现上述目的，以上所述质控物采用以下方法制备：a)灭活处理：将临床阳性样本或微生物培养物放置60℃恒温水浴锅中，浸泡30分钟；b)稀释液的配制：具体由10mmol/L～15mmol/L的β-巯基乙醇、0.05mol/L～0.1mol/L的8-羟基喹啉、2mol/L～5mol/L的醋酸钠、5％～10％[w/v]十二烷基肌氨酸钠、10％～15％[w/v]异硫氰酸胍，0.01mol/L～0.05mol/L的Tris-HCl，0.01mol/L～0.05mol/L的乙二胺四乙酸，0.1％～0.5％[v/v]的Triton-100，3％～8％[v/v]的丙三醇，0.08％～0.1％[w/v]叠氮钠组成；c)初步定值：将已灭活处理的临床阳性样本或病毒培养物，采用实时荧光定量PCR法对待测质控物进行初步定值；d)质控物的配制：利用RNA保护剂稀释液将临床阳性样本/病毒培养物稀释成所需的浓度水平；其中，临床阳性样本/病毒培养物与RNA保护剂稀释液的比例要大于1∶4；e)分装：在万级洁净区内的II级生物安全柜内进行分装，分装量每管0.5ml，分装完毕(-20±5)℃环境中保存；取样检验合格后方可进入下道工序；f)分析性能评估：①均匀性评估；②稳定性评估：长期稳定性评估(-20℃)。g)定值：利用已知标准物质进行比较定值，采用市场上应用比较广泛、试剂性能比较优良的3～5家核酸定量检测试剂盒对已知标准物质和待测质控物进行标准PCR检测，确定待测量值；h)不确定度的评估：①不均匀性引入的不确定度评定；②稳定性引入的不确定度评定；③定值过程引入的不确定度评定(包括不确定度的A类评定和不确定度的B类评定)。本专利技术的创新点在于：本专利技术得到的质控物为真实病毒样本，并非假病毒或质粒片段。临床检验上要获得可靠的测定结果就必须进行严格的室内质量控制，其中合格稳定的质控物是质量控制的重要前提，而RNA病毒离体后容易受到外界环境的影响而降解，因此造成RNA类质控物的不稳定性。本专利技术制备的RNA类质控物无需冻干并能在室温环境下稳定8天或者在2～8℃环境下稳定32天，并在-20℃条件下保存12个月以上，可用于实验室的室内/室间质量控制，有效监控仪器状态、人员操作、试剂盒有效性等，保证检测结果的准确性和可靠性。下面结合具体实施例方式对本专利技术进行说明，以使公众更好地理解本
技术实现思路
及应用。具体实施方式以下仅为本专利技术的优选实施方式，本专利技术的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本专利技术公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本专利技术的保护范围之内。因此，本专利技术的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例1本实施例提供RNA保护剂稀释液的配制方案(以100ml为例)(1)用量筒量取40mlDEPC·H2O加入灭菌烧杯中；(2)吸取0.1mlβ-巯基乙醇加入烧杯中，并搅拌均匀；(3)吸取2.5ml8-羟基喹啉(2mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；(4)称取16.4g的醋酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；(5)称取10g的十二烷基肌氨酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；(6)称取15g的异硫氰酸胍加入烧杯中，并搅拌溶解；(7)称取0.12g的Tris-HCl加入烧杯中，并搅拌溶解；(8)吸取10mlENDA(0.5mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；(9)吸取0.5mlTriton-100加入烧杯中，并搅拌均匀；(10)吸取5ml丙三醇加入烧杯中，并搅拌均匀：(11)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中，并搅拌溶解；(12)用浓盐酸调pH值至4.8～5.2；(13)把已经调好pH的溶液转移到100ml的容量瓶中，用DEPC.H2O定容到100ml；(14)把配制好的溶液置于试剂瓶中，密封后高压灭菌，室温备用。实施例2本实施例提供RNA类核酸定值质控物阴阳性样本制备方案。(1)阴性血浆(血清)样本筛选出外观性状外观包装完整，无破损，无渗漏。有明确标识，标明供血单位、供血者信息、制备时间、效期、体积、贮存条件等。融化后应呈淡黄色均一液体，无明显絮状沉淀物或大块沉淀的样本，而且污染性的测定(PCR法)结果为阴性。将合格的阴性血浆经56℃60分钟灭活处理后，在一万级工作区内的II级生物安全柜内用灭菌医用纱布过滤除去纤维蛋白，于-20±5℃环境中保存备用。(2)阳性血浆(血清)样本用PCR-荧光定量检测试剂盒筛选出阳性血浆(血清)，筛选出特性量值高的阳性血浆(血清)，进行合并，混合均匀。再用PCR-荧光定量检测试剂盒对混合后的阳性血浆(血清)定值，-80℃环境中冷冻保存备用。(3)微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA核酸类定值质控物，其特征在于定值质控物中由临床阳性样本或病毒培养物、RNA保护剂稀释液组成；其中，临床阳性样本类型为血清或血浆；RNA核酸可以是HIV‑1 RNA、HCV RNA、RV RNA、EV71 RNA、CA16 RNA、IVB RNA、IVA RNA、PIV RNA和RTA RNA其中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种RNA核酸类定值质控物，其特征在于定值质控物中由临床阳性样本或病毒培养物、RNA保护剂稀释液组成；其中，临床阳性样本类型为血清或血浆；RNA核酸可以是HIV-1RNA、HCVRNA、RVRNA、EV71RNA、CA16RNA、IVBRNA、IVARNA、PIVRNA和RTARNA其中的任意一种。2.根据权利要求1所述的定值质控物，其特征在于采用以下方法制备：(1)主要原材料的选择、制备；(2)质控物的配制以及分装；(3)分析性能评估；(4)质控物的定值和不确定度的评定。3.根据权利要求2所述的定值质控物的配制以及分装，其特征在还在于具体制备包括以下步骤：(1)灭活处理：将临床阳性样本或病毒培养物放置56℃恒温水浴锅中，浸泡30分钟；(2)RNA保护剂的配制：由10mmol/L～15mmol/L的β-巯基乙醇、0.05mol/L～0.1mol/L的8-羟基喹啉、2mol/L～5mol/L的醋酸钠、5％～10％[w/v]十二烷基肌氨酸钠、10％～15％[w/v]异硫氰酸胍，0.01mol/L～0.05mol/L的Tris-HCl，0.01mol/L～0.05mol/L的乙二胺四乙酸，0.1％～0.5％[v/v]的Triton-100，3％～8％[v/v]的丙三醇和0.08％～0.1％[w/v]叠氮钠组成；将配制好的溶液置于试剂瓶中，密封后高压灭菌，室温备用；(3)初步定值：将已灭活处理的临床阳性样本或病毒培养物，采用荧光定量PCR法对待测质控物进行初步定值；(4)质控物的配制：利用RNA保护剂稀释液将已知浓度的临床阳性样本或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尔华，高旭年，王清涛，华文浩，钟凤然，吴淑贤，
申请(专利权)人：广州邦德盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44