一种沙门氏菌的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种沙门氏菌的快速检测方法，该检测方法的步骤为：将沙门氏菌接种到混合蛋白胨大豆肉场培养基中培养得菌悬液；在避光条件下向菌悬液加入叠氮溴乙锭溶液，黑暗中静置，然后开盖置于冰上，曝光，离心，弃上清，用超纯水重悬，沸水浴，离心，上清液即为DNA模板；基于GeneBank公布的沙门氏菌特异性invA基因序列，使用引物设计软件对PCR引物进行设计；将提取DNA模板用无菌超纯水稀释，进行PCR扩增；选用“最大二阶导数法”进行分析，以CP值判断结果。有益效果为：本发明专利技术检测方法特异性、重复性好，增菌效率、灵敏度、准确率高，可快速鉴别沙门氏菌死态和活态细菌，检测成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌的快速检测方法
本专利技术涉及微生物检测
，尤其涉及一种沙门氏菌的快速检测方法。
技术介绍
近年来，随着人民生活水平的提高，我国食品卫生状况得到了很大的改善，但食源性致病微生物的流行暴发事故仍屡见报道，食品中致病菌污染是食品安全最重要的危害因素，也是食物中毒的最主要原因。近年来，沙门氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌O157、弯曲杆菌等食品致病菌已成为危害食品安全的头号杀手。其中，沙门氏菌是常见食源性致病菌之一，是一种能够寄生于人类和动物肠道内，对人和畜禽健康有极大危害的常见的人畜共患病致病菌。该致病菌不仅能够引起多种动物疾病，如：鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、流产等，还能够使人类患伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎、感染性腹泻等疾病，引起食物中毒。世界各地每年由其引起的食物中毒病例高居榜首，它不仅严重危害人类的健康，还会造成巨大的经济损失。目前，沙门氏菌的检测主要有细菌分离培养法和PCR法，前者作为实验室的金标准，需要反复增菌、菌落分离及多种生化、血清学鉴别实验等，操作复杂、耗时长，后者主要基于微生物的DNA核酸进行扩增检测，而细菌无论是在活菌还是死菌状态下都存在DNA核酸，从而导致有些PCR检测阳性的样本中实际并无活的致病菌，这与现行的传统致病菌检测标准不一致，即现有的基于DNA的PCR检测方法及标准不能区别样本中存在的活态和死态微生物，成为应用PCR技术检测致病菌的瓶颈。正是基于这个原因，目前已经颁布的相关标准中，PCR技术并未作为常规诊断方法，而只是用来对已经分离培养好的致病菌进行快速鉴定，不能对样品中的致病菌进行直接检测，这在美国等发达国家都莫不如此。因此，为适应进出口检验检疫中货物快速通关验放的需要，缩短检测时间，增加已有分子生物学检测方法的准确性，避免不必要的资源浪费，有效降低工作量，研究出一种沙门氏菌的快速检测方法势在必行。现有技术如授权公告号为CN104278102B的中国专利技术专利，公开了一种沙门氏菌的四重PCR检测方法。该检测方法将hns基因(152bp)、fliM基因(418bp)、invA基因(681bp)和Hut基因(495bp)，作为PCR检测的四个基因靶点，将扩增这4个基因片段的4对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参数调整优化，建立直接从样品中检测沙门氏菌的四重PCR检测方法。与传统PCR不同，该检测方法一方面具有四重保险的特点，提高检测的准确性和可靠性，另一方面还可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势，起到一箭双雕的效果。但是该方法不能区别样本中存在的活态和死态微生物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性、重复性好，增菌效率、灵敏度、准确率高，可快速鉴别沙门氏菌死态和活态细菌，检测成本低的活态沙门氏菌的快速检测方法。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种沙门氏菌的快速检测方法，包括增菌培养、DNA模板制备、引物的设计与合成、PCR反应体系建立、结果判断，其具体步骤如下：增菌培养：将沙门氏菌接种到混合蛋白胨大豆肉场培养基中，在35-40℃下增菌培养6-10h，即得菌悬液，备用，上述混合蛋白胨为比例为1:0.8-1.2的胰蛋白胨和鱼粉蛋白胨混合蛋白胨，该培养基能为沙门氏菌生长提供更丰富的碳源、氮源、无机盐等，增菌效果显著，使得沙门氏菌能尽快达到对数生长期，此时细菌结构稳定，代谢、生理特性比较一致且良好，防御能力最强，叠氮溴乙锭作用难度最大；DNA模板制备：取培养菌悬液1ml，避光条件下加入浓度为0.05mg/mL的叠氮溴乙锭溶液（EMA），使EMA终浓度达到2.0-4.0mg/L，轻微振荡混匀，黑暗中静置14-16min，然后将菌液取出，距离灯管14-16cm，开盖置于冰上，用600-700W卤钨灯持续曝光5-10min使叠氮溴乙锭光解，将样品取出后置于转速为10000-15000r/min的离心机中离心2-5min，弃上清，用超纯水重悬1次，然后沸水浴18-22min，再置于温度为0-5℃、转速为10000-15000r/min的离心机中离心4-6min，上清液即为DNA模板，备用，该步骤中EMA作为一种新型的DNA插入型荧光染料，能插入到细胞壁或细胞膜不完整的死细胞DNA中，当用高强度的可见光曝光激活EMA时，会产生有活性的氮宾中间体，中间体与DNA紧密共价结合形成复合物而使其失去继续扩增能力，体系中游离的EMA氮宾活性中间体与体系中的水结合形成羟胺，从而使EMA完全被消耗掉，不会影响后续DNA扩增，而活细胞完整的细胞壁与细胞膜能够阻止EMA染料的进入，由于羟胺的形成，有效避免了对活菌DNA扩增的影响，从而可不用将活菌和死菌分开而直接检测活菌，同时该步骤DNA溶于超纯水中，得到的DNA可直接作为双重荧光PCR扩增模板，且该提取DNA模板方法不耗费试剂，操作简单、直接、快速，获得DNA量更多，纯度也可达到试验要求；引物的设计与合成：基于GeneBank公布的沙门氏菌特异性invA基因序列，使用引物设计软件PrimerPremier5.0对PCR引物进行设计，特异性扩增沙门氏菌序列，引物序列为：正向引物SalmF：5’-ACGTTCGGGCAATTCGTT-3’，反向引物SalmR：5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’，上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，灵敏度高、扩增效率高，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行；PCR反应体系建立：将提取DNA模板用无菌超纯水做10倍梯度稀释，进行PCR扩增，上述PCR反应总体积25μL，内含PremixExTaq(ProbeqPCR)12.5μL、10μM引物各0.5μL、ddH2O7.5μL、DNA模板1μL，PCR反应参数：37℃5min，94℃预变性3min，94℃变性20s，60℃退火延伸45s（检测荧光信号），40个循环；结果判断：根据LightCycler480荧光定量PCR仪操作手册，选用“最大二阶导数法”进行分析，以CP值（crossingpoint，指扩增曲线产生荧光突跃时的循环次数）判断结果，CP值≤35判为阳性，CP值≥40判为阴性，CP值介于35-40之间，应适当增加模板量重做试验，该检测方法特异性、重复性好，灵敏度高，可快速鉴别沙门氏菌死态和活态细菌，检测结果符合我国现行的传统细菌分离培养法检测标准，具有较高的应用价值和推广前景。作为优选，增菌培养步骤中培养基中含有3.0-3.2g/L的5号胆盐和2.8-3.2g/L的半胱氨酸，半胱氨酸中左旋体和与右旋体的比例为100:0.35-0.4，培养基中5号胆盐和半胱氨酸的加入能有效富集沙门氏菌，抑制非沙门氏菌的生长，起到较好的选择性培养作用，提高了增菌效率，以便单独分离出沙门氏菌用于后续的检测，最终提高食品中沙门氏菌的检测速率和准确率；同时半胱氨酸中左旋体和与右旋体的特殊配比能够使得沙门氏菌死菌的细胞膜结构的受损程度增大，进而使得后续EMA能够快速通过死菌细胞的膜结构而发挥作用，提高检测速率和和准确率。作为优选，菌株基因组DNA的提取步骤中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沙门氏菌的快速检测方法，包括增菌培养、DNA模板制备、引物的设计与合成、PCR反应体系建立、结果判断，其特征在于：所述增菌培养步骤为：将沙门氏菌接种到混合蛋白胨大豆肉场培养基中进行增菌培养，即得菌悬液，所述培养基中含有5号胆盐和半胱氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌的快速检测方法，包括增菌培养、DNA模板制备、引物的设计与合成、PCR反应体系建立、结果判断，其特征在于：所述增菌培养步骤为：将沙门氏菌接种到混合蛋白胨大豆肉场培养基中进行增菌培养，即得菌悬液，所述培养基中含有5号胆盐和半胱氨酸。2.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述培养基中含有3.0-3.2g/L的5号胆盐和2.8-3.2g/L的半胱氨酸，所述半胱氨酸中左旋体和与右旋体的比例为100:0.35-0.4。3.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述混合蛋白胨为比例为1:0.8-1.2的胰蛋白胨和鱼粉蛋白胨混合蛋白胨。4.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述DNA模板制备步骤为：取培养菌悬液，避光条件下加入叠氮溴乙锭溶液（EMA），轻微振荡混匀，黑暗中静置14-16min，然后将菌液取出，距离灯管14-16cm，开盖置于冰上，用600-700W卤钨灯持续曝光5-10min使叠氮溴乙锭光解，将样品取出后离心，弃上清，用超纯水重悬1次，然后沸水浴18-22min，离心，上清液即为DNA模板。5.根据权利要求4所述的一种沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述菌悬液为1ml，EMA溶液浓度为0.05mg/mL，菌悬液中EMA终浓度为2.0-4.0mg/L。6.根据权利要求4所述的一种沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述菌株基因组DNA的提取步骤中EM...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾小敏，
申请(专利权)人：曾小敏，
类型：发明
国别省市：贵州,52