一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物包括以下呼吸道病原体中的任意一种或多种：冠状病毒、流感病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、鼻病毒或/和嗜肺军团菌。本发明专利技术将冠状病毒的全长基因组序列划分为6个目的片段，每个片段的长度为4000～5500bp。本发明专利技术的质控物覆盖了冠状病毒所有检测靶序列(或靶点)，覆盖面广泛，检测靶点全面，不会出现漏检的现象。本发明专利技术的质控物包含了主要的感染呼吸道病原体，涵盖的范围较广，且以真实病毒样本以及慢病毒样本为原材料，具有更准确的检测靶点。本发明专利技术制备冠状病毒质控物通过慢病毒载体将靶基因序列整合到宿主基因组中，并在制备过程中敲除了自主复制的基因，并具有“自我失活”能力，使该重组慢病毒不能在靶细胞内复制并感染其他细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法
本专利技术属于医学检验
，具体涉及一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法。
技术介绍
呼吸道感染是最常见的感染性疾病，由呼吸道传染病病原体引起，主要是病原体通过感染鼻腔、气管等呼吸系统而导致呼吸道感染。呼吸道病毒是指一大类以呼吸道为侵入门户在呼吸道黏膜上皮细胞增殖引起急性呼吸道组织感染或其他组织器官病变的病毒。据统计90％以上原发急性上呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的，而该种病毒引发下呼吸道感染的几率达62％。研究表明，一些呼吸道病原体，如中东呼吸综合征病毒、禽流感病毒等，由于这些病毒体经呼吸道途径传播的传染特性导致其传播速度快、流行范围广，人群中发病率高，极易引起流行及暴发，对社会影响较大。由于可引发呼吸道感染的病原体种类繁多，患者可能携带不止一种病原体，不同病毒之间以及病毒和细菌之间的临床体征和症状相互重叠，往往使得仅基于临床表现的病因诊断变得困难，无法确定致病原因，导致常规治疗无效，造成抗生素滥用以及医源性交叉感染，而对呼吸道病原体进行快速检测有助于诊断和准确用药，因此需要研制相应的质控物，可对快速检测过程进行质量控制，保证检测结果的准确性和可靠性。在病毒感染初期对病原学进行及时准确的诊断，有助于医护人员精准掌握患者病情，也是急性传染病防控工作顺利实施的重要保障。最先检出新的病原体的方法是下一代测序技术/高通量测序技术(NGS)技术，并且很快确定了新冠病毒的核酸序列。2020年3月3日，国家卫生健康委员会(卫健委)发布了新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)，确诊病例要求同时具备以下病原学或血清学证据之一：实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体检测阳性。其中病毒核酸检测具有窗口期短，用时少，灵敏度高，特异性强等优点，能在病毒早期快速诊断和动态观察抗病毒治疗的效果。然而核酸检测也会存在一定的假阴性率和潜在的假阳性结果。实验室层面上的“假阴性”是指所采集的样本中病毒含量高于所用检测试剂的检测限(亦称分析敏感性)，但实验室却没有检出。要想尽可能避免“假阴性”，实验室需满足：(1)选择可靠的体外诊断试剂；(2)规范的临床核酸检测(合理分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系)。数字PCR(DigitalPCR，dPCR)技术是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时，利用样品的有限稀释，让每个孔中只获得单个模板分子，通过计算PCR后的扩增信号，以期准确地确定起始分子的数量，虽然没有明确提出“数字PCR”的概念，但是已经建立了数字PCR基本的实验流程，并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein和Kinzler等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时，因受到体细胞基因的干扰，而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈，而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式，从而提出了数字式PCR的概念，同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高，从而指出了数字PCR系统的发展方向。目前，英国国家生物制品检定所作为WHO指定的国际标准品实验室，是目前全世界最主要的国际标准品和参考品生产者和分发者，生产超过95％的国际标准品。而我国的质控物数量虽然较多，但品种不全、门类欠缺、结构不合理。品种主要集中在钢铁、地矿和建材等领域，在生物工程、食品成分、临床化学以及新材料、新能源等一些重要发展领域内的质控物则相对比较缺乏。相关质控物的研制相对滞后，使得不少产品的检测无法实现，不得不靠国外进口来满足实验室检测要求。由于这些进口质控物的生产者执行的管理体系不同，量值准确性和溯源性也不同，难以确保我国测量结果的有效性和一致性。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂质控物的需求和依赖也越来越强烈。因此，加强体外诊断试剂质控物建设，不仅有利于诊断结果的准确一致，使各医院的检测结果具有可比性，而且也是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。由于生物样本的活性较为复杂与多变，核酸极易受缓冲环境的影响而降解，特别是RNA，容易受到无处不在的核酸酶的降解。同时，核酸检测试剂盒的性能验证实验，特别是检测限(灵敏度)、线性等的评估实验，常需要不同浓度的企业参考品、阳性对照、质控物进行有效的试剂盒性能验证评估。因此，研制一经济而质量稳定、量值可靠、又无生物危害的质控物，其定值和稳定性考察是必不可少的过程，也是研制质控物的重要环节，也是本专利技术的重要部分。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物，包括以下呼吸道病原体核酸中的任意一种或多种：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌或/和嗜肺军团菌。本专利技术的质控物包含了主要的感染呼吸道病原体，涵盖的范围较广，且以真实病毒样本以及假病毒样本为原材料，具有更准确的检测靶点。优选地，所述冠状病毒的核酸为6个4000～5500bp核酸片段。本专利技术将冠状病毒的全长基因组序列划分为6个目的片段，每个片段的长度为4000～5500bp。由此，本专利技术的质控物覆盖了冠状病毒所有检测靶序列(或靶点)，覆盖面广泛，检测靶点全面，不会出现漏检的现象；同时，在每个片段前后末端设计了Overlap，可有效避免检测试剂的探针序列落在分段位置而影响最终的检测结果。优选地，所述冠状病毒包括：人冠状病毒HCoV-NL63、人冠状病毒HCoV-229E、人冠状病毒HCoV-HKU1、人冠状病毒HCoV-OC43、SRSA-CoV、MERS-CoV或/和新型冠状病毒。优选地，所述流感病毒包括：甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H5N1、甲型流感病毒H7N9、甲型流感病毒H9N2、乙型流感病毒(IVB)、呼吸道合胞病毒(RSV)或/和副流感病毒(PIV)。优选地，所述稀释液包括以下组分：二甲基亚砜、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白、异硫氰酸胍、Tris-HCl、乙二胺四乙酸和丙三醇；所述稀释液pH值为7.2～7.6。本专利技术的稀释液具有保护核酸的功效，提高核酸的稳定性。优选地，所述呼吸道病原体核酸的质控物中人冠状病毒HCoV-NL63的标准值为1.2×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-229E的标准值为1.9×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-HKU1的标准值为1.3×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-OC43的标准值为2.0×104copies/μL，严重急性呼吸综合征本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物，其特征在于，包括以下呼吸道病原体核酸中的任意一种或多种：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌或/和嗜肺军团菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物，其特征在于，包括以下呼吸道病原体核酸中的任意一种或多种：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌或/和嗜肺军团菌。


2.如权利要求1所述的质控物，其特征在于，所述冠状病毒的核酸为6个4000～5500bp核酸片段。


3.如权利要求1所述的质控物，其特征在于，所述冠状病毒包括：人冠状病毒HCoV-NL63、人冠状病毒HCoV-229E、人冠状病毒HCoV-HKU1、人冠状病毒HCoV-OC43、SRSA-CoV、MERS-CoV或/和新型冠状病毒；所述流感病毒包括：甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H5N1、甲型流感病毒H7N9、甲型流感病毒H9N2、乙型流感病毒(IVB)或/和副流感病毒(PIV)。


4.如权利要求1～3任一项所述的质控物，其特征在于，还包括稀释液，所述稀释液包括以下组分：二甲基亚砜、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白、异硫氰酸胍、Tris-HCl、乙二胺四乙酸和丙三醇；所述稀释液pH值为7.2～7.6。


5.如权利要求1～4任一项所述的质控物，其特征在于，所述人冠状病毒HCoV-NL63的标准值为1.2×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-229E的标准值为1.9×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-HKU1的标准值为1.3×104copies/μL，人冠状病毒HCoV-OC43的标准值为2.0×104copies/μL，SRSA-CoV的标准值为2.0×104copies/μL，MERS-CoV的标准值为1.8×104copies/μL，新型冠状病毒的标准值为1.6×104copies/μL，甲型流感病毒H1N1的标准值为1.1×104copies/μL，甲型流感病毒H5N1的标准值为1.9×104copies/μL，甲型流感病毒H7N9的标准值为1.5×104copies/μL，甲型流感病毒H9N2的标准值为1.3×104copies/μL，乙型流感病毒的标准值为2.3×104copies/μL，呼吸道合胞病毒的标准值为2.2×104copies/μL，副流感病...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尔华，高旭年，钟凤然，吴淑贤，
申请(专利权)人：广州邦德盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44