区分样品中活微生物和死亡微生物的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列来区分样品中的活微生物和死亡微生物的方法。具体地，根据本发明专利技术的方法基于在存在RNA标记剂的情况下培养的样品中核苷酸取代水平的比较。本发明专利技术还涉及一种诊断对象中微生物感染的方法；以及实施根据本发明专利技术的区分方法来评估样品污染风险的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】区分样品中活微生物和死亡微生物的方法专利
本专利技术涉及一种通过区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列来区分样品中的活微生物和死亡微生物的方法。具体地，根据本专利技术的方法基于在存在RNA标记剂的情况下培养的样品中核苷酸取代水平的比较。本专利技术还涉及一种诊断对象中微生物感染的方法；以及实施根据本专利技术的用于区分的方法来评估样品污染风险的方法。
技术介绍
检测细胞中病毒的能力，更一般地说，检测微生物的能力，在诊断领域有许多应用，其中它被证明可用于鉴定导致例如疾病的感染因子；在生物医学研究中，它决定了实验结果的解释；或潜伏污染样品的安全评估；或生物技术过程中使用的微生物的生存能力。除了目前依赖于微生物特异性核酸序列扩增的标准检测技术之外，已经出现了几种技术来规避仅基于扩增的技术的主要限制，即不能区分死亡微生物和活性(或复制型)微生物，包括潜伏病毒。在筛选生物样品方面，建立这种区分的能力是至关重要的，因为活性微生物制剂的存在可能会产生不同于与存在死亡和/或无活性微生物特别是病毒的相关后果。这些技术可以基于对复制型病毒具有特异性序列的检测：在DNA病毒的情况下RNA的存在，在反义单链RNA病毒的情况下正义相对于反义RNA的化学计量，在正义单链RNA病毒的情况下反义RNA(反基因组)的存在，和在逆转录病毒的情况下DNA和正义剪接RNA的存在。这些技术基于反向互补链的扩增，例如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，或基于高通量测序方法的RNA测序(RNA测序，也称为全转录组鸟枪法测序)，特别是双链RNA测序技术。目前的技术仍然有几个局限性：首先，目前的技术不允许区分污染型RNA和与样品中复制型微生物——例如病毒——存在相关的RNA，污染型RNA例如样品中独立于活性微生物——例如活性病毒颗粒——存在的复制中间体。这样的技术在检测复制型双链RNA病毒方面的效率仍有待验证。在正义单链RNA病毒的情况下，产生的少量反义RNA种类阻碍了现有检测技术的灵敏度。在反义单链RNA病毒的情况下，很难区分正链反基因组和特定转录物，需要对病毒物种进行特定的生物信息学分析。与复制型病毒(更广泛地说，复制型微生物)的存在相关的RNA种类的另一个特征是与潜伏的污染型RNA相反，它们处于合成过程中(即，在病毒的情况下，在宿主细胞中；或者在其他微生物的情况下，直接在细菌、真菌或其他中)。已经描述了几种标记和纯化新生转录物的技术(也称为RNA代谢标记技术)。例如，4-硫代尿苷(4SU)或其他类型的尿苷类似物(BudR)的掺入已被用于纯化新生真核mRNA转录物和/或研究转录网络的动力学(Herzog等人,2017.NatMethods.14(12):1198-1204；Tani等人,2012.RNABiol.9(10):1233-8)。在本文，专利技术人设计、优化和验证了一种用于检测病毒感染的细胞(包括新的病毒株/物种)的方法，该方法依赖于利用代谢标记检测生物样品细胞内的病毒RNA合成。专利技术人在此还表明，当依赖于使用代谢标记检测样品中的微生物RNA合成时，该方法对于任何具有转录活性微生物的检测也是容易实现的。这些包括例如，检测活微生物引起的病毒、细菌、古菌、真菌或原生动物感染或污染，以及与死亡微生物残留物的区分。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于区分样品中的活微生物和死亡微生物的体外方法，其包括区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列，其中该方法包括以下步骤：(a)对从样品中提取的第一组RNA进行测序，其中所述第一组RNA是通过在RNA标记剂存在的情况下培养样品并进一步通过将所提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；从而获得第一组序列读段；(b)将与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列读段中的经取代核苷酸的数量和对照序列中的经取代核苷酸的数量进行比较；和(c)如果在第一组序列读段中与至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中的经取代核苷酸的数量大于在对照序列中随机取代的核苷酸数量，则推断至少一个微生物核酸序列命中属于活微生物。在一个实施方案中，用于区分样品中的活微生物和死亡微生物的体外方法包括区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列，其中该方法包括以下步骤：(a)对从样品中提取的第一组RNA进行测序，其中所述第一组RNA是通过在RNA标记剂存在的情况下培养样品并进一步通过将所提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；从而获得第一组序列读段；(b)将与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列读段中的经取代核苷酸的数量和对照序列中的经取代核苷酸的数量进行比较；和(c)如果与在第一组序列读段中至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中的经取代核苷酸的数量大于在对照序列中随机取代的核苷酸数量，则推断至少一个微生物核酸序列命中属于活微生物，其中对照序列不是与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在没有RNA标记剂的情况下培养样品而获得的。在一个实施方案中，对照序列选自：-与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，其中所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在没有RNA标记剂的情况下培养样品而获得的；-与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，其中所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在存在RNA标记剂的情况下培养样品但没有将提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；-从与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列的序列读段或重叠群中获得的共有微生物核酸序列；-与在核酸序列数据库中鉴定的最接近的微生物株中发现的相同微生物核酸序列对应的序列；和/或-与核酸序列数据库中鉴定的相同微生物核酸序列命中对应的类似序列。在一个实施方案中，对照序列选自：-与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，其中所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在存在RNA标记剂的情况下培养样品但没有将提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；-从与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列的序列读段或重叠群中获得的共有微生物核酸序列；-与在核酸序列数据库中鉴定的最接近的微生物株中发现的相同微生物核酸序列命中对应的序列；和/或-与核酸序列数据库中鉴定的相同微生物核酸序列命中对应的类似序列。在一个实施方案中，本专利技术的体外方法包括：(a)对从样品中提取的第一组和第二组RNA进行测序，其中所述第一组RNA和所述第二组RNA是通过在存在RNA标记剂的情况下培养样品而获得的，从而获得经标记的RNA，和其中第一组RNA是从置于允许核苷酸取代的条件的经标记的RNA的第一部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于区分样品中的活微生物和死亡微生物的体外方法，其包括区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列，其中所述方法包括以下步骤：/n(a)对从样品中提取的第一组RNA进行测序，其中所述第一组RNA是通过在RNA标记剂存在的情况下培养样品并进一步通过将所提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；从而获得第一组序列读段；/n(b)将与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列读段中经取代的核苷酸的数量和对照序列进行比较；和/n(c)如果在第一组序列读段中与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中经取代的核苷酸的数量大于在对照序列中随机取代的核苷酸的数量，则推断至少一个微生物核酸序列命中属于活微生物，/n其中对照序列不是与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在没有RNA标记剂的情况下培养样品而获得的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180620 EP 18305777.7;20190403 EP 19305439.21.一种用于区分样品中的活微生物和死亡微生物的体外方法，其包括区分样品中具有转录活性的微生物核酸序列和具有转录惰性的微生物核酸序列，其中所述方法包括以下步骤：
(a)对从样品中提取的第一组RNA进行测序，其中所述第一组RNA是通过在RNA标记剂存在的情况下培养样品并进一步通过将所提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下而获得的；从而获得第一组序列读段；
(b)将与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列读段中经取代的核苷酸的数量和对照序列进行比较；和
(c)如果在第一组序列读段中与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中经取代的核苷酸的数量大于在对照序列中随机取代的核苷酸的数量，则推断至少一个微生物核酸序列命中属于活微生物，
其中对照序列不是与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在没有RNA标记剂的情况下培养样品而获得的。


2.根据权利要求1所述的体外方法，其中所述对照序列选自：
-与所述至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段，其中所述第二组序列读段是通过对第二组RNA进行测序而获得的，所述第二组RNA是通过在存在RNA标记剂的情况下培养样品但没有将提取的RNA置于允许核苷酸取代的条件下获得的；
-从与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列的序列读段或重叠群中获得的共有微生物核酸序列；
-与在核酸序列数据库中鉴定的最接近的微生物株中发现的相同微生物核酸序列对应的序列；和/或
-与核酸序列数据库中鉴定的相同微生物核酸序列命中对应的类似序列。


3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其包括：
(a)对从样品中提取的第一组和第二组RNA进行测序，
其中所述第一组和第二组RNA是通过在存在RNA标记剂的情况下培养样品而获得的，从而获得经标记的RNA，和
其中第一组RNA是从置于允许核苷酸取代的条件下的经标记的RNA的第一部分获得的，第二组RNA是从没有置于允许核苷酸取代的条件下的经标记的RNA的第二部分获得的，
从而获得第一组序列读段和第二组序列读段，
(b)将与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第一组序列读段中经取代的核苷酸的数量和与至少一个微生物核酸序列命中匹配的第二组序列读段中经取代的核苷酸的数量进行比较，和
(c)如果在第一组序列读段中与至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中经取代的核苷酸的数量大于在第二组序列读段中与至少一个微生物核酸序列命中匹配的序列读段中经取代的核苷酸的数量，则推断至少一个微生物核酸序列命中属于活微生物。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其中所述RNA标记剂是硫醇标记的RNA前体。


5.根据权利要求4所述的体外方法，其中所述硫醇标记的RNA前体选自4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2,4-二硫尿苷、2-硫代-4-脱氧尿苷、5-乙氧甲酰基-2-硫代尿苷、5-羧基-2-硫代尿苷、5-(正丙基)-2-硫代尿苷、6-甲基-2-硫代尿苷和6-(正丙基)-2-硫代尿苷，从而获得硫代尿苷标记的RNA；优选地，硫醇标记的RNA前体是4-硫代尿苷。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中允许核苷酸取代的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·艾利奥特，帕斯卡莱·博德莱，史迪文·克吕韦耶，
申请(专利权)人：帕特霍奎斯特公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR