用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组及其构建方法技术

本发明专利技术公开用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组及其构建方法，所述用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组序列如SEQ ID NO.1‑36所示，可以实现对18重靶标的同时扩增，适用于临床筛查呼吸道感染病例及多重呼吸道病毒复合感染病例，单次检测可以实现对17种可能感染类型的同时筛查，能降低检测成本，节省检测时间，适用于突发卫生事件的应急检测与常规检测。

【技术实现步骤摘要】
用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组及其构建方法
本专利技术涉及生化领域，主要涉及用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组及其构建方法。
技术介绍
急性呼吸道感染常见于儿童及青少年，在幼儿和老年感染者等抵抗力较弱群体中有较高的致死率。急性呼吸道感染常见的病原体有细菌、病毒、衣原体等，其中超过80%的感染由呼吸道病毒引发。自进入二十一世纪来，全球多次遭受呼吸道病毒侵扰，如：禽流感、SARS、MERS等。2019年末开始席卷全球的新型冠状肺炎病毒（CoVID-19）至今仍在严重危及人类的健康和生命安全。由于这些病毒感染的潜伏期短、临床症状复杂和流行特点相似，给临床诊断造成极大的困难且易产生误诊，因此很难进行针对性治疗，容易加重患者的病情或导致抗生素滥用。确定感染者的感染类型对遏制病毒传播、提前采取预防措施及临床治疗尤为重要，因此发展快速的病毒检测方法对早期临床诊断有着重要意义。传统检测呼吸道病原体的方法有分离病毒培养法和血清学分析，但是这两方法由于操作相对复杂、耗时长、灵敏度低，已经无法满足临床检验的需求。除此之外，基于免疫学反应检测病毒特异性抗原或抗体的方法虽然在可操作性和检测时长方面有改善，但是抗原抗体检测存在明显的窗口期，同时灵敏度较差。相比之下，核酸检测具有更高的灵敏度，在病毒感染早期也有较高的检出率。目前主流的方法是基于病毒核酸的快速体外扩增实现对病毒类型的检测，包括：荧光定量PCR、基因芯片、毛细管电泳检测等。常见的核酸检测试剂多数针对一种病毒的核酸序列设计特异性的引物，所以只限于检测某种病原体，无法检出其他可能感染的病毒类型。例如：中山大学达安基因股份有限公司申请的专利-一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒（CN105624335A），针对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）设计了特异性引物对，虽然实现了对MERS-CoV的特异性和高灵敏度检测，但是应用于临床对呼吸道感染疑似病例进行筛查时存在明显的缺陷。因此，核酸多重检测方案孕育而生，目前实现多重检测的方案主要有：固相/液相芯片法、毛细管电泳法、溶解曲线法、核酸-质谱法等。多重PCR体系中存在针对不同靶序列设计的多种引物对，可以实现在一个反应体系中对多种靶标核酸的同时扩增。多重核酸检测体系的检测重数除了受限于检测手段外，关键在于多重引物组的构建，随引物对数量增加，不同引物对之间的相互干扰问题越严重，且往往很难避免。这也是影响多重检测体系构建的最主要因素。因此，多重核酸检测体系往往只能同时检测几种病原体。例如：在专利-多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒（CN112063756A）中，受限于荧光定量PCR的荧光通路数量，该专利设计的多重检测体系能实现对三种常见呼吸道病毒的筛查（甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒）。多重PCR体系构建存在多种干扰因素。一方面，不同引物对之间容易相互干扰从而产生非特异性扩增或引物二聚体，最终导致体系非特异性增加及对靶标核酸的扩增效率下降；另一方面，基于PCR产物大小分析的多重检测体系可能存在优先扩增短片段的现象，导致不同靶序列的扩增效率差距进一步扩大。这些问题都阻碍了多重PCR体系的构建。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组及其构建方法，所述引物组可以同时检测17种呼吸道病毒。本专利技术提出的构建多重核酸检测引物组的方法适用于大多数的多重检测体系，利用该方法构建的引物组能与多种检测手段联合（固/液相芯片、核酸质谱、毛细管电泳等）组成核酸检测试剂盒。本专利技术的技术方案如下：用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其中，包括以下18种引物对：用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.1-2所示；用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.3-4所示；用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.5-6所示；用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.7-8所示；用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.9-10所示；用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.11-12所示；用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.13-14所示；用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.15-16所示；用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.17-18所示；用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.19-20所示；用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.21-22所示；用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.23-24所示；用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.25-26所示；用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.27-28所示；用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.29-30所示；用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.31-32所示；用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.33-36所示；每种引物对中均有一条引物的5’端带有修饰标记。所述的用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其中，所述修饰标记包括荧光素修饰或生物素修饰；所述荧光素修饰包括FAM、TET、HEX或TAMRA。所述的用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其中，所述用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组中各引物对的浓度范围如下：用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，每条引物的浓度为0.5-0.75μM；用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.75μM；用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.75μM；用于扩增人博卡病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.35-0.6μM；用于扩增人腺病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.5μM；用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，每条引物的浓度为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其特征在于，包括以下18种引物对：/n用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；/n用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.3-4所示；/n用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；/n用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.7-8所示；/n用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.9-10所示；/n用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.11-12所示；/n用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.13-14所示；/n用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.15-16所示；/n用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.17-18所示；/n用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.19-20所示；/n用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.21-22所示；/n用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 23-24所示；/n用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 25-26所示；/n用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 27-28所示；/n用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 29-30所示；/n用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.31-32所示；/n用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.33-36所示；/n每种引物对中均有一条引物的5’端带有修饰标记。/n...

【技术特征摘要】
1.用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其特征在于，包括以下18种引物对：
用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.1-2所示；
用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.3-4所示；
用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.5-6所示；
用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.7-8所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.9-10所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.11-12所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.13-14所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.15-16所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.17-18所示；
用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.19-20所示；
用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.21-22所示；
用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.23-24所示；
用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.25-26所示；
用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.27-28所示；
用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.29-30所示；
用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.31-32所示；
用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQIDNO.33-36所示；
每种引物对中均有一条引物的5’端带有修饰标记。


2.根据权利要求1所述的用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其特征在于，所述修饰标记包括荧光素修饰或生物素修饰；
所述荧光素修饰包括FAM、TET、HEX或TAMRA。


3.根据权利要求1所述的用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组，其特征在于，所述用于呼吸道感染病毒检测的多重引物组中各引物对的浓度范围如下：
用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；
用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；
用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；
用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，每条引物的浓度为0.5-0.75μM；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.75μM；
用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；
用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；
用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.45μM；
用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.75μM；
用于扩增人博卡病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.35-0.6μM；
用于扩增人腺病毒基因的引物对，每条引物的浓度为0.3-0.5μM；
用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；
用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，每条引物的浓度为0.35-0.5μM；
用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，每条引物的浓度为0.35-0.55μM；
用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，每条引物的浓度为0.2-0.4μM；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟嘉俊，顾桐旭，褚春旭，白鹏利，
申请(专利权)人：季华实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44