本发明专利技术公开了一种SARS‑CoV‑2 D614G突变检测试剂盒及检测方法，本发明专利技术的SARS‑CoV‑2 D614G突变核酸检测的引物及探针序列如SEQ ID NO：1‑4所示。本发明专利技术的SARS‑CoV‑2 D614G突变检测试剂盒采用不对称PCR扩增，结合多色探针熔解曲线分析技术，可实现对SARS‑CoV‑2 S‑D614和S‑G614毒株的分型检测，具有操作简单、检测周期短、灵敏度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种SARS-CoV-2D614G突变检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种SARS-CoV-2D614G突变检测试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，SARS-CoV-2)与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β属冠状病毒。SARS-CoV-2可引起人类呼吸道感染，造成致命的肺部炎症，称为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。COVID-19是一种新发的急性呼吸道传染病，在人群中具有极强的传染性，主要通过呼吸道飞沫、呼吸道分泌物和直接接触传播。SARS-CoV-2属于正链RNA病毒，具有5个必需基因，分别编码4种结构蛋白：核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)，及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。核蛋白(N)包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜(E)，病毒包膜包埋有基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)等蛋白。冠状病毒的得名来自暴露于病毒脂质层外面的由棘突蛋白(spikeprotein，S蛋白)构成的冠状突起，利用S蛋白与靶细胞表面的特异性受体结合，进入细胞内复制而引起感染。经研究发现，SARS-CoV-2利用S蛋白与人类受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconvertingenzyme2，ACE2)结合进而侵入宿主细胞。RNA病毒极易发生突变，这可能与其传播和毒性相关。目前，SARS-CoV-2根据其基因组的突变情况已经进化出多个不同的典型分支，其中最重要的突变是S蛋白D614G突变。D614G突变指的是新型冠状病毒S蛋白第614氨基酸位点D(天冬氨酸)到G(甘氨酸)的突变，在病毒基因组上的改变是23403位的碱基A突变为碱基G(在MN908947.3基因组的位置，23403A->G)。D614G突变的毒株通常伴有214C->T、3037C->T和14408C->T变异。D614G变异毒株最早出现在欧洲，目前已成为世界范围内的主要流行毒株。根据GISAID数据库公布新冠病毒基因组序列，发现携带该突变的病毒株主要是G型、GR型和GH型。综合多项研究来看，新型冠状病毒S蛋白D614G突变使棘状蛋白数量增加4-5倍，并使这些蛋白更稳定，进而使病毒更容易侵入人体细胞。在实验室环境下，D614G突变的新冠病毒感染人细胞的能力提高9-10倍，并且能够降低对个体恢复期血清的敏感性，但是D614G突变在现实环境下对新冠病毒感染力的影响仍待研究。协助SARS-CoV-2进入宿主细胞的刺突蛋白是疫苗和治疗剂的主要靶标之一，因此，持续监测D614G变异是了解SARS-CoV-2感染性和抗原性的关键。目前，D614G突变的监测依赖于全基因组测序技术，尚无关于D614G突变检测的分子诊断试剂。全基因组测序不仅耗时长、价格高，还需要专门的仪器设备和专业的生物信息分析人员，不利于大范围开展工作，特别是对于一些基层单位。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，在于提供SARS-CoV-2D614G突变核酸检测的引物及探针序列，其如SEQIDNO：1-4所示。本专利技术的目的之二，在于提供SARS-CoV-2D614G突变核酸检测试剂盒，包括前述的引物及探针序列。本专利技术的目的之三，在于提供SARS-CoV-2D614G突变核酸检测方法，包括如下步骤：1)合成所述的引物及探针序列；2)采集样品，进行核酸提取及纯化；3)RT-PCR反应成分及用量：4)RT-PCR扩增和溶解程序48-52℃，13-17min，1-3个循环；93-97℃，4-6min，1-3个循环；93-97℃,13-17s，53-57℃，13-17s,74-78℃，18-22s,45-55个循环；93-97℃，0.5-2min，1-3个循环；35-40℃，2-4min，1-3个循环；以0.02-0.06℃/s的升温速率从35-40℃升温至80-90℃，与此同时采集荧光信号；5)结果判读。本专利技术步骤2)所述的样品包括但不限于商品(例如进口冷冻食品)、环境中的样品(例如下水道、土壤)等。本专利技术的再一目的，在于提供所述的检测方法在检测D614和/或G614毒株中的应用。本专利技术的再一目的，在于提供所述的检测方法在检测非D614和/或G614的新型冠状病毒毒株中的应用。本专利技术开发了一种基于核酸变异分析技术的新型冠状病毒D614G突变检测试剂盒及方法。本专利技术采用不对称PCR和多色探针熔解曲线分析技术，通过荧光通道和熔点(Tm)的二维标签，识别新型冠状病毒S-D614和S-G614毒株，具有操作简单、检测周期短、灵敏度高等优点：(1)本专利技术开发的新型冠状病毒D614G突变检测试剂盒无需PCR后处理，操作简便快速，3个小时内即可得到病毒检测结果和病毒分型结果，且无需特殊设备，适用于实时分型工作。(2)本专利技术所使用的引物探针均为自行设计，通过大量新冠病毒基因组序列的比对，选择S基因上覆盖D614G突变(23403A->G)的保守区域进行引物设计。并且通过将新冠病毒参考基因序列(GenBank：MN908947.3)与NCBI数据库发布的SARS-CoV(GenBank：NC_004718.3)、bat-SL-CoVZC45(GenBank：MG772933.1)基因序列比对，在新型冠状病毒保守且特异的区域设计扩增引物。因此，本专利技术试剂盒不仅可用于新型冠状病毒S-D614和S-G614毒株的分型检测，还可直接用于新型冠状病毒的检测。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为本专利技术实施例的典型结果图。具体实施方式1.本专利技术试剂盒引物探针本专利技术选取新型冠状病毒S基因上覆盖D614G突变(23403A->G)的保守区域进行引物、探针设计。针对D614和G614分别设计一条检测探针，其中D614检测探针5′端标记ROX荧光基团，3′端标记淬灭基团；G614检测探针5′端标记FAM荧光基团，3′端标记淬灭基团。经过引物探针组合大量筛选，最终确定的引物、探针序列如下表所示：表1.SARS-CoV-2D614G突变检测试剂盒引物、探针序列注：“+”指LNA修饰。2.样品处理采集疑似COVID-19患者的鼻咽拭子、口咽拭子、前鼻和中鼻拭子、鼻咽冲洗/鼻吸取物或支气管肺泡灌洗(BAL)样品。使用厦门致善生物科技股份有限公司生产的手工提取试剂盒“病毒RNA提取试剂盒(货号：602101)”进行核酸提取及纯化。提取试剂盒的提取纯化过程包括4个步骤：裂解、结合、洗涤和洗脱。提取时，取1mL待测样品加入提取加样孔，然后按照提取试剂盒说明书中的操作方法进行提取。提取试剂盒中核酸洗脱体积为60μL，提取后获得的RNA应立即使用或储存在-70℃保存。3.本专利技术试剂盒RT-PCR反应体系组分针对RT-PCR反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.SARS-CoV-2 D614G突变核酸检测的引物及探针序列，如SEQ ID NO：1-4所示。/n
【技术特征摘要】
1.SARS-CoV-2D614G突变核酸检测的引物及探针序列，如SEQIDNO：1-4所示。
2.SARS-CoV-2D614G突变核酸检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及探针序列。
3.SARS-CoV-2D614G突变核酸检测方法，包括如下步骤：
1)合成权利要求1所述的引物及探针序列；
2)采集样品，进行核酸提取及纯化；
3)RT-PCR反应成分及用量：
OnestepRT-PCRbuffer12.0-12.5μL
50μM的SEQIDNO：10.02-0.05μL
50μM的SEQIDNO：20.1-0.5μL
50μM的SEQIDNO：30.1-0.5μL
50μM的SEQIDNO：40.1-0.5μL
混合酶0.5-1.5μL
DEPC-H2O补充至20μL；
4)RT-PCR扩增和溶解程序
48-52℃，13-17min，1-3个循环；93-97℃，4-6min，1-3个循环；93-97℃,13-17s，53-57℃，13-17s,74-78℃，18-22s,45-55个循环；93-97℃，0.5-2min，1-3个循环；3...
【专利技术属性】
技术研发人员：张永有，宋娜杰，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门致善生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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