一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用，所述的多重PCR引物组是由用于检测DAdV‑2的引物和用于检测DuCV的引物组成。采用双重PCR引物组快速检测DAdV‑2和DuCV的双重PCR方法，实现了在同一个反应体系中同时扩增两种病毒，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染。该方法对DAdV‑2和DuCV的检测与鉴别、疫病监测及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用
本专利技术属于禽类病毒检测
具体涉及一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用。
技术介绍
鸭2型腺病毒(Duckadenovirus2，DAdV-2)属腺病毒科禽腺病毒属，为线状双链DNA病毒。该病主要发生在20～30日龄鸭，患病鸭主要表现为精神萎靡、沉郁和消瘦，排浅黄白色的粪便。病理变化为肝脏肿大并有白色针尖状坏死点灶，肾脏及脾脏肿大充血，胰腺有白色点状坏死。该病1977年首次在法国的番鸭中流行，2014年奥地利科学家AnaMarek通过高通量测序技术获得该病毒全序列。2015年由陈峰等应用宏基因组学分离、鉴定出国内首株鸭2型腺病毒。目前该病已广泛流行于广东、福建、浙江等水禽养殖密集地区，给养鸭业造成了巨大的经济损失。鸭圆环病毒(Duckcircovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属新成员，DuCV常呈潜伏感染，并入侵鸭的免疫系统，导致鸭机体的免疫功能下降，对多种条件性病原抵抗性减弱，使其更易遭受其他致病因素的侵袭。而一旦发生混合感染(如鸭流感病毒、鸭腺病毒、鸭大肠杆菌等)，感染鸭机体的死亡率就会大大提升。同时，DuCV还会导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状，所以圆环病毒作为一种重要的病原微生物，对我国养殖业的危害不容忽视。上述两种病原均为DNA病毒，临床引起症状具有一定的相似性，易发生混合感染，极大的增加临鉴别诊断的难度。而常规的诊断方法，如动物实验、免疫学和病毒分离培养，在临床诊断中存在诊断时间长、敏感性低以及操作繁琐等缺点，在临床中不易于快速诊断上述两种疾病。因此，急需建立一种快速、准确、灵敏的检测方法来诊断和监控上述两种病原，确保养鸭业的健康发展。PCR是实验室常用检测方法之一，其具有快速、灵敏、成本低、操作简单等优点；该方法不仅能进行快速确定病毒种类，还能检测病毒的早期感染和潜伏感染。但是检测时如果使用扩增单种病毒的引物对待测样品进行鉴别，则可能需要准备多份样品扩增多次才能确定感染的病毒类型，不仅在实际操作中需要增加检测次数，另外还会引起交叉感染。双重PCR是在单一PCR基础上建立起来，其优点在于通过一次PCR的反应，可以同时检测并鉴别两种病原，在临床中具有重要的应用价值。目前国内外尚未报道可同时检测鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒的双重PCR检测方法。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用。该引物组解决了单一PCR操作繁琐、交叉污染风险高的问题，能够对鸭群中鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒进行鉴别诊断，对鸭群中鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒流行病学调查及防控提供了可靠的检测手段，具有重要的临床应用价值。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组，所述的双重PCR引物组由用于检测DAdV-2的引物和用于检测DuCV的引物组成，用于检测DAdV-2的引物的核苷酸序列为：上游引物F1：5’-CGATGGAACGACAGTAAA-3’下游引物R1：5’-AAACGAAAAAGCAAGAGC-3’用于检测DuCV的引物的核苷酸序列为：上游引物F2：5’-GTGGTGGGACGGTTACTCGG-3’下游引物R2：5’-TTTATTGGGAACGGGAGGGT-3’上述的引物组在制备检测DAdV-2和DuCV的试剂中的应用。一种含有上述的双重PCR引物组的试剂盒。采用上述的双重PCR引物组同时检测DAdV-2和DuCV的方法，该方法包括以下步骤：(1)采用常用方法合成用于检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组；(2)提取待检测样品的总DNA，以提取的总DNA为模板，采用步骤(1)合成的双重PCR引物组进行PCR扩增反应；(3)分析PCR扩增产物，进行结果判定。进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：上游引物F1、下游引物R1以及上游引物F2、下游引物R2各0.5μL，各引物的终浓度为0.4pmol/μL；2×TaqMasterMix酶12.5μL；DNA模板各1μL；灭菌后ddH2O补足至25μL；所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；94℃90s，94℃20s，54℃30s，72℃20s，30个循环，最后一个循环72℃延伸5min。进一步地，步骤(3)所述分析PCR扩增产物具体为对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类；样品中有DAdV-2时，扩增产物中会出现598bp左右的条带；样品中有DuCV时，扩增产物中会出现297bp左右的条带；样品中含有DAdV-2和DuCV混合感染时，扩增产物中会出现598bp和297bp左右两条条带。与现有技术相比，本专利技术具有以下积极有益效果本专利技术提供了一种能够快速检测DAdV-2和DuCV两种病毒的双重PCR引物组，前期通过对DAdV-2和DuCV两种病毒全基因组分析，依据其保守基因区设计了上述两对引物，引物组退火温度相近，扩增目的片段大小接近，两对引物之间无相互干扰，才使得后续组成引物组使用；该引物组在实际操作中，仅对DAdV-2和DuCV两种病毒基因组进行扩增，而不引起非特异性的反应，引物组特异性强；本专利技术的快速检测DAdV-2和DuCV两种病毒的双重PCR方法可以对同一份样品获取的DNA为模板，进行PCR扩增；并根据扩增产物的大小，通过琼脂糖凝胶电泳判断待检样品感染病毒种类，实现在同一个反应体系中同时扩增两种病毒；本专利技术检测方法在实际操作中简便，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染，节约检测时间和试剂消耗。由于建立的检测方法针对的病毒保守区基因扩增，其针对性强，灵敏度高，最少核酸检出量达到pg级。在临床检测中能够达到简便、经济、快捷和准确的检验要求；通过本专利技术建立的双重PCR方法，实现在同一反应管中同时对两种病原体的鉴别检测，对动物源性产品中DAdV-2和DuCV的检测与鉴别、疫病监测及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。附图说明图1为鸭2型腺病毒不同退火温度结果图；M：Marker2000；泳道1：51.9℃；泳道2：53.8℃；泳道3：56.1℃；泳道4：58.0℃；泳道5：59.2℃；图2为鸭腺圆环病毒不同退火温度结果图；M：Marker2000；泳道1：50.5℃；泳道2：53.1℃；泳道3：54.9℃；泳道4：56.4℃；泳道5：57.4℃；图3DAdV-2和DuCV双重PCR不同引物浓度条件下的检测结果图；M：Marker2000；泳道1：引物浓度20pmol/μL；泳道2：引物浓度10pmol/μL；泳道3：引物浓度5pmol/μL；泳道4：引物浓度1pmol/μL；泳道5：引物浓度0.5pmol/μL；图4为D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组，其特征在于，所述的双重PCR引物组由用于检测DAdV-2的引物和用于检测DuCV的引物组成，/n用于检测DAdV-2的引物的核苷酸序列为：/n上游引物F1：5’-CGATGGAACGACAGTAAA-3’/n下游引物R1：5’-AAACGAAAAAGCAAGAGC-3’/n用于检测DuCV的引物的核苷酸序列为：/n上游引物F2：5’-GTGGTGGGACGGTTACTCGG-3’/n下游引物R2：5’-TTTATTGGGAACGGGAGGGT-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组，其特征在于，所述的双重PCR引物组由用于检测DAdV-2的引物和用于检测DuCV的引物组成，
用于检测DAdV-2的引物的核苷酸序列为：
上游引物F1：5’-CGATGGAACGACAGTAAA-3’
下游引物R1：5’-AAACGAAAAAGCAAGAGC-3’
用于检测DuCV的引物的核苷酸序列为：
上游引物F2：5’-GTGGTGGGACGGTTACTCGG-3’
下游引物R2：5’-TTTATTGGGAACGGGAGGGT-3’。


2.权利要求1所述的引物组在制备检测DAdV-2和DuCV的试剂中的应用。


3.一种含有权利要求1所述的双重PCR引物组的试剂盒。


4.采用权利要求1所述的双重PCR引物组同时检测DAdV-2和DuCV的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)合成用于检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组；
(2)提取待检测样品的总DNA，以提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬普雨，王新港，晋盈辉，李新，姬星宇，张先峰，周欣，李厚伟，丁丽萍，
申请(专利权)人：商丘美兰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41