一种DNA核酸类定值质控物及其制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种靶值定值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好，且具有较高的使用价值的DNA类核酸定值质控物，DNA类核酸定值质控物质控物由临床阳性样本或微生物培养物和冻干保护剂组成，涵盖11种感染性微生物项目的检测，并且采用高特异性、高灵敏度的微滴数字PCR进行检测，无需标准曲线、可直接定量，确定其标准值，可以满足一般的科研、临床使用。本发明专利技术具有测值稳定，均匀性好，定值准确，可溯源性，与临床样本的互通性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA核酸类定值质控物及其制备方法所属领域本专利技术属于医学检验
，属于聚合酶链式反应(PCR)
脱氧核糖核酸(DNA)类生物制品范畴，具体涉及一种感染类微生物DNA类核酸定值质控物及其制备方法。专利技术背景数字PCR(DigitalPCR，dPCR)技术是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时，利用样品的有限稀释，让每个孔中只获得单个模板分子，通过计算PCR后的扩增信号，以期准确地确定起始分子的数量，虽然没有明确提出“数字PCR”的概念，但是已经建立了数字PCR基本的实验流程，并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein和Kinzler等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时，因受到体细胞基因的干扰，而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈，而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式，从而提出了数字式PCR的概念，同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高，从而指出了数字PCR系统的发展方向。目前，英国国家生物制品检定所作为WHO指定的国际标准品实验室，是目前全世界最主要的国际标准品和参考品生产者和分发者，生产超过95％的国际标准品。而我国的质控物数量虽然较多，但品种不全、门类欠缺、结构不合理。品种主要集中在钢铁、地矿和建材等领域，在生物工程、食品成分、临床化学以及新材料、新能源等一些重要发展领域内的质控物则相对比较缺乏。相关质控物的研制相对滞后，使得不少产品的检测无法实现，不得不靠国外进口来满足实验室检测要求。由于这些进口质控物的生产者执行的管理体系不同，量值准确性和溯源性也不同，难以确保我国测量结果的有效性和一致性。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂质控物的需求和依赖也越来越强烈。因此，加强体外诊断试剂质控物建设，不仅有利于诊断结果的准确一致，使各医院的检测结果具有可比性，而且也是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。研制一经济而质量稳定、量值可靠的质控物，其定值和稳定性考察是必不可少的过程，也是研制质控物的重要环节，也是本专利技术的重要部分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有较高的使用价值的DNA类核酸定值质控物，具体品种包括：艾滋病病毒2型(HIV-2)DNA，Epstein-Barr病毒(EBV)DNA，人巨细胞病毒(HCMV)DNA，乙型肝炎病毒(HBV)DNA，解脲脲原体(UU)DNA，淋球菌(NG)DNA，沙眼衣原体(CyT)DNA，肺炎支原体(MP)DNA，结核杆菌(TB)DNA，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)DNA，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)DNA。本专利技术的质控物具有靶值定值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好的特点。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：(1)引物探针的设计(2)通过qPCR方法的建立以及反应条件的优化，最终确定DNA类核酸质控物的微滴式数字PCR反应体系是Supermix5μL，Reversetranscriptase(酶)2μL，300mMDTT1μL，10μM引物1μL，10μM探针0.5μL，模板2μL，纯水8.5μL。反应条件是50℃2min；95℃10min；95℃30s，55℃45s45个循环；4℃60min(升降温速率2℃/s)。(3)以上所述质控物采用以下方法制备：a)灭活处理：将临床阳性样本/微生物培养物放置60℃恒温水浴锅中，浸泡30分钟。b)冻干保护剂的配制：5％-10％(w/v)BSA，1％-5％(w/v)甘氨酸，1％-5％(w/v)蔗糖，3％-7％(w/v)海藻糖，1％-5％(w/v)β-环糊精，1％-10％(w/v)甘露醇，1％-5％(w/v)胰蛋白胨，1％-5％(w/v)D-山梨醇。c)初步定值：将已灭活处理的临床阳性样本/微生物培养物，采用微滴式数字PCR法对待测质控物进行初步定值。d)质控物的配制：利用冻干保护剂把临床阳性样本或微生物培养物稀释成所需的浓度水平。临床阳性样本或微生物培养物与保护剂的比例范围在1∶1～1∶10。e)分装：在万级工作区内的II级生物安全柜内进行。分装量每管0.5ml。分装完毕(-20±5)℃环境中保存。取样送检。合格后方可进入下道工序。f)冷冻干燥：-40℃10h；0.15℃/min→-30℃10h；0.15℃/min→-20℃4h，0.15℃/min→4℃，6h；0.15℃/min→25℃32h。g)分析性能评估：①均匀性评估；②稳定性评估：长期稳定性评估(-20℃)。h)定值：采用微滴式数字PCR法对待测质控物进行绝对定量检测，确定待测量值。i)不确定度的评估：不均匀性引入的不确定度评定；稳定性引入的不确定度评定；定值过程引入的不确定度评定(包括不确定度的A类评定和不确定度的B类评定)。本专利技术的创新点在于：本专利技术得到的质控物为真实病毒样本，并非假病毒或质粒片段，采用绝对定量微滴式数字PCR方法进行定值，在-20℃条件下保存12个月以上，可用于实验室的室内/室间质量控制，有效监控仪器状态、人员操作、试剂盒有效性等，保证检测结果的准确性和可靠性。下面结合附图和具体实施例方式对本专利技术进行说明，以使公众更好地理解本
技术实现思路
及应用。附图说明图1HIV-2标准品扩增曲线图图2HIV-2标准品标准曲线图图3操作者1的微滴分布图图4操作者1的微滴生成图图5操作者2的微滴分布图图6操作者2的微滴生成图图7操作者3的微滴分布图图8操作者3的微滴生成图图9操作者4的微滴分布图图10操作者4的微滴生成图具体实施方式以下仅为本专利技术的优选实施方式，本专利技术的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本专利技术公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本专利技术的保护范围之内。因此，本专利技术的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例1——HIV-2DNA微滴式数字PCR的方法建立(1)引物和探针的设计：根据HIV-2基因序列相关资料，借助PrimerPremier5.0生物软件设计2对PCR引物探针。表1HIV-2gag-gp105基因组PCR扩增的引物和探针(2)病毒核酸的提取(天根磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒)a.向干净的1.5ml离心管中加入20μl蛋白酶K。b.向离心管中加入200μl血浆/血清/淋巴液(样品需平衡至室温)。c.向样本中加入400μlCarrier工作液，盖上管盖，涡旋振荡10秒混。d.在56℃或室温孵育10分钟。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。e.加入400μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡10秒，彻底混。f.加入15μl磁珠悬浮液G，盖上管盖并涡旋振荡10秒，彻底混。在室温(15-25℃)放置5分钟。g.将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。h.将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混。i.将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；j.将离心管从磁力架上取下，加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA核酸类定值质控物，其特征在于其由临床阳性样本或微生物培养物和冻干保护剂组成；其中，临床阳性样本类型为血清或血浆；DNA核酸可以是HIV‑2 DNA、EBV DNA、HCMV DNA、HBV DNA、UU DNA、NG DNA、CT DNA、MP DNA、TB DNA、HSV‑1 DNA和HSV‑2DNA中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种DNA核酸类定值质控物，其特征在于其由临床阳性样本或微生物培养物和冻干保护剂组成；其中，临床阳性样本类型为血清或血浆；DNA核酸可以是HIV-2DNA、EBVDNA、HCMVDNA、HBVDNA、UUDNA、NGDNA、CTDNA、MPDNA、TBDNA、HSV-1DNA和HSV-2DNA中的任意一种。2.一种DNA核酸类定值质控物的制备方法，其特征在于定值质控物的制备方法包含以下步骤：1)主要原材料的选择、制备以及检测方法的建立；2)质控物的配制、分装以及冻干；3)分析性能评估；4)定值和不确定度的评定。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征还在于步骤1)所述检测方法为微滴数字RT-PCR绝对定量方法，包括设计1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，以及优化的PCR反应条件和反应体系。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征还在于所述的1对特异性引物和1条特异探针为以下序列中的其中一种：1)HIV-2DNA：2)EBVDNA：3)HCMVDNA：4)HBVDNA：5)UUDNA：6)NGDNA：7)CTDNA：8)MPDNA：9)TBDNA：10)HSV-1DNA：11)HSV-2DNA：且以上所述正反引物浓度均为400nMol，探针浓度均为500nMol。5.根据权利要求3所述的PCR反应条件和反应体系，其特征还在于：1)所述PCR反应体系：Supermix5μL，Reversetranscriptase2μL，300mMDTT1μL，10μM引物1μL，10μM探针0.5μL，模板2μL，纯水8.5μL；2)所述PCR扩增条件：50℃2min；95℃10min；95℃30s→55℃45s，45个循环；4℃60min；扩增过程中升降温速率均为2℃/s。6.根据权利要求3的所述质控物的制备方法，其特征还在于所述步骤3)包含以下具体操作：1)灭活处理：将临床阳性样本或微生物培养物放置60℃恒温水浴锅中，浸泡30分钟；2)冻干保护剂的配制：5％-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尔华，高旭年，王清涛，华文浩，钟凤然，吴淑贤，
申请(专利权)人：广州邦德盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44