重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。本发明专利技术的重组人Neuritin蛋白，其独特的作用将达到甚至超过给予单独的Notch阻断剂或单独使用神经营养因子对损伤毛细胞的再生或营养作用，从而起到治疗感音神经性耳聋及相关疾病的用途。然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

【技术实现步骤摘要】
重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用
本申请属于生物医药
，具体地说是重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。
技术介绍
感音神经性耳聋是一种常见的耳疾，尽管导致感音神经性聋的途径和机制多样，但内耳毛细胞的不可逆损伤是造成感音神经性聋的核心原因。目前临床上常用的助听器和人工耳蜗虽然可部分改善患者的听力，但无法从根本上修复受损细胞的结构和功能，且其治疗效果也需依赖于残留毛细胞和螺旋神经元的数量和质量。因此探讨毛细胞损伤后再生的方法和策略是近来听觉领域研究的重点。毛细胞为感受声波刺激的感觉上皮细胞，其作用是把声音转化为送给大脑的电子刺激。在声波经过的时候，毛细胞表面的纤毛摆动将声波的机械能转换成神经生物电信号，这些信号经由神经纤维传给大脑。哺乳动物的内耳毛细胞数量恒定、且为终末分化细胞，损伤后不可逆，亦不具有再生修复能力。研究表明，耳蜗支持细胞是毛细胞再生的主要来源。哺乳动物的耳蜗支持细胞(包括Hensen细胞、Deiters细胞以及内外柱细胞等)和毛细胞在发育过程中均来源于同一前体细胞。前体细胞在向毛细胞和支持细胞定向分化的过程中受到多种信号通路的调控，其中Notch信号通路以侧抑制的方式参与毛细胞的分化调节，在维持耳蜗感觉上皮细胞数量和结构稳态方面发挥重要作用。研究显示，哺乳动物毛细胞损伤后，抑制Notch通路能够促进支持细胞转分化生成新的毛细胞。Neuritin是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子，能够促进神经突起的生长及其分支和突触的发育成熟、调节突触回路的形成，并可抑制凋亡，维持神经元的存活。是神经营养因子和神经活动发挥作用的共同下游因子，也是介导雄激素和电刺激促进神经再生的必须和关键分子。在坐骨神经及脊髓损伤模型中显示出良好的促进损伤组织结构及功能恢复的作用。此外，Neuritin能够下调Notch信号通路，减少其受体NICD及下游靶基因HES1的表达。以上研究提示Neuritin在感音神经性耳聋的损伤修复中可能具有重要作用。目前，关于耳聋的治疗研究多使用Notch通路阻断剂DAPT，LY411575等小分子化合物通过阻断Notch促进毛细胞的再生，这种方法再生的毛细胞具有离子通道活性但没有神经再支配作用，影响了再生毛细胞的功能。而诱导毛细胞的神经再支配需要BDNF，NT-3等神经营养因子的参与。Neuritin是一种能够抑制Notch通路的神经营养因子，也是BDNF，NT-3，NGF等发挥作用的下游效应因子。其独特的作用将达到甚至超过给予单独的Notch阻断剂或单独使用神经营养因子对损伤毛细胞的作用。
技术实现思路
有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是提供了重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。感音神经性耳聋为噪音损伤、药物损伤、衰老等导致的耳蜗毛细胞损伤而支持细胞未明显损伤的疾病。重组人Neuritin蛋白添加至体外培养耳蜗组织的培养基后，重组人Neuritin蛋白剂量依赖性地促进新生鼠耳蜗corti组织中支持细胞大量增殖转分化为毛细胞，使毛细胞数量增加；重组人Neuritin蛋白的给药浓度范围为2，4，8，16，32，64μg/mL；诱导时间为3天。重组人Neuritin蛋白剂量、时间依赖性地诱导耳蜗corti组织中毛细胞损伤后的再生及排列，随着作用时间延长，再生的毛细胞形态和排列逐渐成熟。重组人Neuritin蛋白的给药浓度范围为4，16μg/mL；诱导时间为毛细胞损伤后的3，5，7天。诱导培养过程中每天进行半量换液，具体方法为在培养基中配制2倍于所需终浓度的重组人Neuritin蛋白(2×)，将原培养基中一半的培养基换为新配置的培养基，至重组人Neuritin蛋白浓度为1倍(1×)。本专利技术的重组人Neuritin蛋白，其独特的作用将达到甚至超过给予单独的Notch阻断剂或单独使用神经营养因子对损伤毛细胞的作用，从而起到治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的用途，当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1是正常情况下Neuirin在耳蜗中的表达和定位的示意图。其中A为Westernblot法检测Neuirtin的蛋白表达情况。B为免疫荧光法检测Neuritin在耳蜗细胞中的定位，结果显示其在耳蜗支持细胞(sox2)和毛细胞(phallodin)均有表达。图2是CBA小鼠药物性耳聋模型的鉴定的示意图。其中A为CBA小鼠药物性耳聋建模前后听力阈值的统计，建模后vs建模前，**：P＜0.01.B为建模前后耳蜗毛细胞(myo7a)及支持细胞(sox2)状态。图3是Neuritin的表达与耳聋的相关性检测的示意图。其中A为Westernblot法检测损伤前及损伤后不同时间段Neuirtin的蛋白表达变化情况。B为A图的量化结果。图4是新生鼠耳蜗corti组织体外培养方法的建立的示意图。其中A为全耳蜗图(wholemount)；B为正常培养条件下毛细胞和支持细胞的数量、形态及位置。图5是不同浓度Neuritin对体外培养corti的毛细胞及支持细胞的影响，以确定Neuritin蛋白的有效作用浓度的示意图。。从左向右为依次为不含Neuritin蛋白的对照组，Neuritin蛋白2，4，8，16，32，64μg/mL处理组，Neuritin组支持细胞减少的地方被毛细胞占据。图6是体外培养的corti中毛细胞损伤模型的建立及Neuritin的再生修复作用研究的示意图。A为3mM庆大霉素损伤24小时后PBS培养3天的耳蜗图；B为3mM庆大霉素与Neuritin4μg/mL共培养24小时后4μg/mL的Neuritin继续培养3天的耳蜗图；C为3mM庆大霉素与Neuritin16μg/mL共培养24小时后16μg/mL的Neuritin继续培养3天的耳蜗图。图7是图6中各组耳蜗顶回毛细胞与支持细胞的形态的示意图。。图8是图6中各组耳蜗中回毛细胞与支持细胞的形态的示意图。。图9是图6中各组耳蜗底回毛细胞与支持细胞的形态的示意图。。图10是Neuritin组中观察到的处于分裂期的毛细胞和增殖的支持细胞的现象的示意图。。图11是图6中各组培养5天的毛细胞与支持细胞的形态的示意图。。图12是图6中各组培养7天的毛细胞与支持细胞的形态的示意图。。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施案例1：Neuritin在耳蜗中的表达及定位情况(1)Neuritin在CBA小鼠耳蜗中的表达情况1)耳蜗总蛋白的提取将2-3只CBA小鼠全身麻醉后，用普通剪刀在颈部紧靠枕骨处剪断颈部皮肤、肌肉和颈椎，断头后剪刀插入枕骨大孔，沿两侧颞骨上方分别剪开暴露左本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.重组人Neuritin蛋白在制备治疗感音神经性耳聋及相关疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，感音神经性耳聋及相关疾病为噪音损伤、药物损伤、衰老等导致的耳蜗毛细胞损伤而支持细胞未明显受损的疾病。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组人Neuritin蛋白添加至体外培养耳蜗组织的培养基后，重组人Neuritin蛋白剂量依赖性地促进新生鼠耳蜗corti组织中支持细胞大量增殖转分化为毛细胞，使外毛细胞数量增加。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组人Neuritin蛋白的给药浓度范围为2，4，8，16，32，64μg/mL；诱导时间为3天，各浓度下外毛细胞数量为108±4.0，117.7±1.86，113±4.0，119.3±2.8，117.7±4.2，114±1.2。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组人Neuritin蛋白剂量、时间依赖性地诱导耳蜗corti组织中毛细胞损伤后的再生及排列。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，重组人Neuritin蛋白的给药浓度为4，16μg/mL；诱导后再生的毛细胞数量为83.3±38.4，94±31，显著高于损伤组的64±15.2；其时间依赖性表现为随着作用时间延长，再生的毛细胞形态和排列逐渐成熟.。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，诱导培养过程中每天进行半量换液，具体方法为在培养基中配制2倍于所需终浓度的重组人Neuritin蛋白(2×)，将原培养基中一半的培养基换为新配置的培养基，至重组人Neuritin蛋白浓度为1倍(1×)。8.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨磊，黄瑾，汪海燕，董玉梅，孙筱品，桂飞，宋晓明，朱井玲，杨怡，洪玉，谌容，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33