治疗眼病的寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及医学和免疫学领域。特别地，它涉及可用于治疗、预防和/或延迟Usher综合征II型和/或USH2A相关的非综合征型视网膜变性(尤其是通过使人USH2A基因中的外显子40和41之间的假外显子(PE40)跳读)的新型反义寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗眼病的寡核苷酸
本专利技术涉及医学和免疫学领域。特别地，它涉及用于治疗、预防和/或延迟Usher综合征II型和/或USH2A-相关的非综合征型视网膜变性的新型反义寡核苷酸。
技术介绍
Usher综合征(USH)和非综合征型视网膜色素变性(NSRP)是视网膜的退行性疾病。USH在临床和遗传上具有异质性，是迄今为止人类中最常见的遗传性耳聋失明类型。USH患者的听力损伤大多是稳定的并且具有先天性，可通过助听器或人工耳蜗部分补偿。NSRP比USH更普遍，每4,000名个体中就有1个发生。USH和NSRP中感光细胞的变性是渐进的，并且经常导致生命的第三十年和第四十年之间的完全失明，从而留下治疗干预的时间。USH2A基因的突变是这两种疾病的最常见原因。突变的范围遍及所有72个USH2A外显子及其侧翼内含子序列，并且包含无义和错义突变、缺失、重复、大重排和剪切变体。迄今为止最频繁突变的外显子是外显子13，其包含两个发现者突变(Usher综合征II型(USH2)患者中的c.2299delG(p.E767SfsX21)和NSRP患者中的c.2276G＞T(p.C759F))。对于外显子50，已经报道了十五种致病突变，其中至少八种明显是蛋白质截短的。USH2A内含子40的第一个深内含子突变(c.7595-2144A＞G)由Vaché等人(2012.HumMutat33：104-8)报道。该突变在内含子40中产生隐蔽的高质量剪切供体位点，导致在突变型USH2AmRNA中包含152bp的异常外显子，并导致翻译过早终止(参见WO2016/005514的图1A和B)。长期以来，将USH和其它视网膜营养不良视为无法治愈的疾病。然而，使用基因增强疗法的几个I/II期临床试验已经在具有RPE65和MYO7A基因突变的LCA/RP/USH患者的选定组中产生了有希望的结果。编码序列的大小(15,606bp)和USH2A基因和mRNA的可变剪切分别阻碍了基因增强疗法，因为目前许多可用载体(例如腺相关(AAV)和慢病毒载体)的负载大小有限。尽管基于反义寡核苷酸(AON)的疗法具有广泛的临床潜力，但它并不常用于脊椎动物的眼中。AON是小的(16-25个核苷酸)多核苷酸分子，其能够干扰剪切，因为它们的序列与靶标前mRNA分子的序列互补。在结合AON后，前mRNA的靶区域不再可用于剪切因子，这导致AON靶向的外显子跳读跳读。在治疗上，这种方法可以以两种方式使用：a)重新引导其中突变激活隐蔽的剪切位点的基因中的正常剪切；和b)以mRNA的阅读框保持完整并且制备(部分)功能性蛋白质的方式使携带(蛋白质-截短的)突变的外显子跳读跳读。对于USH2A基因，72个外显子中的28个可能跳读跳读而不会干扰转录物的总阅读框。基于AON的两种方法都成功应用于患有严重遗传性疾病的患者。Liquori等人(2016.HumMutat37：184-193)显示AON能够阻止在USH2A基因的mRNA中包含由内含子50中的c.9959.4159A＞G突变引起的155bp假外显子(pseudoexon)50(PE50)。本专利技术的一个目的是提供一种方便的治疗策略，用于预防、治疗或延迟由人USH2A基因的外显子40和41之间的内含子中存在的c.7595-2144A＞G突变引起的USH和/或NSRP。之前已经提出过(Vaché等人，2012)，并且之后证明(WO2016/005514)，AON能够阻断USH2A前mRNA的异常剪切，这种异常剪切由导致包含假外显子40：PE40的这种突变引起。值得注意的是，需要进一步改善的替代物，其表现更好并且具有额外的有益特性。本专利技术的目的是提供这样的替代物。
技术实现思路
本专利技术涉及反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA中跳读假外显子40(PE40)，其中包含假外显子是由于USH2A基因中的c.7595-2144A＞G，并且其中所述AON包含选自以下任何序列组的序列：(i)SEQIDNO：6、4、8、23、30、31、32、37；(ii)SEQIDNO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36；和(iii)SEQIDNO：21、27、28、29。在另一个实施方式中，本专利技术还涉及能够诱导从人USH2A前mRNA中跳读PE40的AON，其中所述AON包含与SEQIDNO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。在优选的实施方式中，本专利技术的AON的长度为18至143个核苷酸，优选18至40个核苷酸，更优选18至30个核苷酸，甚至更优选18至24个核苷酸，并且最优选由选自SEQIDNO：6、3、4、5、7、8、19、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36和37的序列，优选选自SEQIDNO：6、3、4、5、7、8、26、34、35和37的序列，更优选选自SEQIDNO：6、3、4、5、7、8、26和35的序列组成。在另一个优选的实施方式中，根据本专利技术的AON包含2′-O-烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰的核糖、2′-O-丙基修饰的核糖、和/或这些修饰的取代衍生物，如卤代衍生物。本专利技术的AON中的一个或多个核苷酸可通过2′-O-甲氧基乙基修饰进行修饰。本专利技术还涉及一组AON，其包含至少两种如本文要求保护的AON。在另一个实施方式中，本专利技术还涉及当置于有利于AON表达的条件下时表达根据本专利技术的AON的病毒载体。在另一个实施方式中，本专利技术涉及一种药物组合物，其包含根据本专利技术的AON、或根据本专利技术的一组AON、或根据本专利技术的病毒载体，和药学上可接受的赋形剂。本专利技术还涉及根据本专利技术的AON、组、载体或组合物，用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症，如Usher综合征II型。附图说明图1示出在HEK293细胞中使用报告构建体，七种备选反义寡核苷酸与本领域的两种已知反义寡核苷酸(分别为AON1和AON2：R1和R2)和不相关的对照寡核苷酸(ctrl)相比，比较PE40外显子跳读效率的初始筛选的逆转录酶结果，在施用USH2a-PE40-3、-5和-7后显示信号明显增加。下图示出相对于PE40序列的不同AON的大致位置。图2示出从5’到3’的PE40序列(粗体并带下划线，并分成两部分)，以及本文测试的不同AON的结合位点。每个测试的AON的SEQIDNO在括号之间给出，名称在表1中给出。PE40序列下游的第一个核苷酸是鸟苷(G)，其代表c.7595-2144A＞G突变。AON1(1)和AON2(2)的位置直接在PE40序列下面给出。斜体序列是PE40的上游和下游序列。如实施例中所概述的和本文所要求保护的三个感兴趣的区域分别围绕USH2a-PE40-3(SEQIDNO：19，粗体)、USH2a-PE40-5(SEQIDNO：21，粗体)和USH2a-PE40-7(SEQIDNO：23，粗体)。图3示出基于图1和2中所示的USH2a-PE40-3、-5和-7的一组寡核苷酸的PE40跳读筛选的逆转录酶结果。显然，AONUSH2a-PE40-8和-11(基于USH2a-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)，其中所述AON包含与SEQ ID NO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.25 GB 1607141.71.反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)，其中所述AON包含与SEQIDNO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。2.反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)，其中所述AON包含选自以下序列组中任一者的序列：(i)SEQIDNO：6、4、8、23、30、31、32、37；(ii)SEQIDNO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36；和(iii)SEQIDNO：21、27、28、29。3.根据权利要求1或2所述的AON，其中USH2AmRNA中PE40的出现是由于USH2A基因中的c.7595-2144A＞G突变。4.根据权利要求1至3中任一项所述的AON，其中所述AON是包含至少一个2′-O烷基修饰比如2′-O-甲基、2′-O-乙基、或2′-O-丙基的寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)。5.根据权利要求4所述的AON，其中所述AON中的所有核苷酸均为2′-O-甲基修饰的。6.根据权利要求1至5中任一项所述的AON，其中所述AON具有至少一个硫代磷酸酯键。7.根据权利要求6所述的AON，其中所有连续核苷酸均通过硫代磷酸酯键互相连接。8.病毒载体，其在置于有助于表达如权利要求1至3中任一项所述的AON的条件下时表达所述AON。9.药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的AON、或根据权利要求8所述的病毒载体，和药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物用于玻璃体内施用。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物用...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·C·范迪鹏，H·L·陈，J·J·图鲁宁，
申请(专利权)人：ProQR治疗上市公司Ⅱ，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL