P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用，能够有效地促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。

【技术实现步骤摘要】
P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用
本专利技术属于医药领域，具体涉及P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用。
技术介绍
端粒是真核细胞线性染色体末端的DNA重复序列与端粒特异性结合蛋白组成的复合物，起到保护染色体末端、维持基因组稳定性的作用。在人类正常的体细胞中，端粒DNA会随着细胞分裂而不断缩短。当端粒缩短到一定长度，端粒会失去保护染色体的功能，被细胞识别成DNA损伤，从而激活DNA损伤应答反应，细胞进而失去分裂的能力走向衰老或是凋亡；而对于不断增殖的肿瘤细胞而言，端粒长度的维持为其不断分裂以及生存提供了重要的保障。对于所有的肿瘤而言，包括卵巢癌、乳腺癌和肺癌等，同一种肿瘤包括端粒酶阳性的，也包括端粒酶阴性的，其中大约80％的肿瘤属于端粒酶阳性的，即其细胞中具有端粒酶，通过表达端粒酶(telomerase)维持端粒长度；而另外的大约20％的肿瘤是端粒酶阴性的，即肿瘤细胞中检测不到端粒酶活性，通过被称为ALT(AlternativeLengtheningofTelomeres)的旁路途径机制延伸端粒，从而维持端粒长度，被称为ALT肿瘤，这些肿瘤细胞不表达端粒酶(即端粒酶阴性肿瘤细胞)。对于原发肿瘤，要么是端粒酶阳性的，要么是端粒酶阴性的(ALT)。现今，端粒酶抑制剂作为抗肿瘤药物已经进入临床阶段，而且显示出了很好的治疗效果。然而，ALT肿瘤细胞由于恶性程度高、抗药性强，现今的许多抗肿瘤药物对其治疗效果并不理想；而且端粒酶抑制剂的使用会促进端粒酶阳性的肿瘤细胞通过激活ALT机制进而对端粒酶抑制剂产生抗性，表现出更高的恶性程度。因此，特异性针对端粒酶阴性肿瘤细胞药物的研发迫在眉睫，也具有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的途径。为此，本专利技术提供了以下式(I)的P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用：以上式(I)化合物P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr为已知的P53抑制剂，化学式为C16H18N2OS·HBr，能够抑制p53依赖性的应答基因转录。根据本专利技术所述的应用，所述端粒酶阴性且p53阳性肿瘤为骨肉瘤。根据本专利技术所述的应用，所述药物含有药学上可接受的载体或赋形剂。实验证明，式(I)的P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr对于多种端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞，包括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的效用。附图说明图1为CCK8检测细胞活力实验的结果。图2为流式细胞法检测细胞凋亡的结果。图3为细胞增殖曲线。图4为体外成瘤实验的结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的应用范围。本实施例中，以人骨肉瘤为例说明式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)在抑制端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞增殖、促进端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞凋亡方面的效用，但应理解的是，虽然仅以人骨肉瘤为例说明其用于制备抗端粒酶阴性肿瘤的药物的用途，但本专利技术所称的“端粒酶阴性p53阳性肿瘤”细胞指缺乏(或检查不到)端粒酶活性、不表达端粒酶的肿瘤细胞，同时表达野生型p53蛋白，包括但不限于例如人骨肉瘤细胞、胶质瘤细胞等。实验证明，式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)对于多种端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞，包括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的效果。实验材料人皮肤成纤维(BJ，正常细胞)细胞株、肺纤维母(MRC-5，正常细胞)细胞株、人非小细胞肺癌(A549、端粒酶阳性p53阳性)细胞株、人乳腺癌(MCF7、端粒酶阳性p53阳性)细胞株、SV-40Z转化肺成纤维(VA13、端粒酶阴性p53阳性)细胞株、人骨肉瘤(U2OS、端粒酶阴性p53阳性)细胞株购自中国典型物种保藏中心(CTCC)。CCK8检测细胞活力实验：将BJ、MRC-5、A549、MCF7、VA13和U2OS以5×103/孔分别接种于96孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入150μl含有相应浓度式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)(0、2.5μM、5μM、20μM、40μM)的培养基，每个药物浓度分别设置3个复孔；72h后，利用CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒对细胞活性进行检测，具体的操作过程按照试剂盒上提供的方法进行操作。CellCountingKit-8(CCK-8)检测试剂盒主要成分为水溶性四唑盐WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜。WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。加药处理第三天，6个细胞株加药后细胞活力结果如图1所示。实验结果表明，端粒酶阴性p53阳性细胞(VA13、U2OS)对于式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)的敏感性明显强于正常细胞株(BJ、MRC5)以及端粒酶阳性p53阳性细胞株(A549、MCF7)。在低浓度式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)的处理下，端粒酶阴性细胞株p53阳性(VA13、U2OS)生长明显受到抑制。流式细胞法检测细胞凋亡：BJ、MRC-5、A549、MCF7、VA13和U2OS以0.1×106/孔分别接种于6孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入2ml含有相应浓度式(I)化合物(P53转录抑制剂Pifithrin-α(PFTα)HBr)(0、20μM、40μM)的培养基，每个药物浓度分别设置3个复孔；72h后，利用0.25％胰蛋白酶(不含EDTA)进行消化收集，离心，并用1×PBS润洗2遍，弃去上清液，保留沉淀(细胞)；收集好的细胞用Fluor488annexinVandPI进行双染，具体的染色操作过程按照Alexa488annexinV/DeadCellApoptosisKit试剂盒上提供的方法进行操作；染色好后的细胞悬浮液直接用流式细胞仪进行测试，实验数据由FlowJo软件进行处理拟合。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合来确定细胞是否处于细胞凋亡早期。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.式(I)的P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用：

【技术特征摘要】
1.式(I)的P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用：2.根据权利要求1所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵勇，葛远龙，伍姝，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44